ЕКСПРЕСІЯ P53, VEGF ТА CD34 У ПУХЛИННІЙ ТКАНИНІ ТА ВИЖИВАНІСТЬ ХВОРИХ НА СЕРОЗНИЙ РАК ЯЄЧНИКА
Бучинська Л.Г., Грінкевич В.М., Юрченко Н.П., Воробйова Л.І.
У операційному матеріалі хворих на рак яєчника (РЯ) досліджено експресію білків р53 і VEGF, а також щільність мікросудин (ЩМС) (за експресією CD34). Виявлено залежність експресії перелічених маркерів від стадії захворювання та віку хворих. Показано, що у РЯ хворих репродуктивного віку досліджені показники вищі, ніж у пацієнток у менопаузальний період. При цьому загальна безрецидивна виживаність перших (пацієнтки віком молодше 45 років) була вірогідно меншою, ніж других (хворі віком старше 45 років). Встановлено, що незалежно від віку хво-рих експресія р53, VEGF, а також ЩМС у пацієнток, які прожили більше 5 років, були вірогідно нижчими, ніж у тих, які прожили 5 і менше років. Комплекс досліджених показників є перспективним для прогнозу перебігу серозного РЯ.
ВСТУП
Ангіогенез відіграє важливу роль у розвитку пух лини і є складним процесом, у регуляції якого бере участь низка біологічно активних речовин. Зокре ма, до стимуляторів судиноутворення у пухлинах належать різноманітні фактори росту з ангіоген ною активністю, які продукують як клітини пух лини і її мікрооточення, так і безпосередньо ендо теліальні клітини. Ключова роль серед активаторів ангіогенезу належить VEGF — потужному мітоген ному фактору ендотеліальних клітин, який стиму лює не тільки проліферацію, а й міграцію клітин ен дотелію і утворення трубчастих структур. Вважаєть ся, що саме цей фактор є специфічним медіатором, що забезпечує підвищену проникність судин у пух линах [1]. Об’єктивним показником, що характе ризує ангіогенез у пухлині, є щільність мікросудин (ЩМС), яка може бути визначена за експресією та ких маркерів як фактор Віллебранда, антигени CD31 та CD34 [2]. Слід зазначити, що CD34 не експресу ється ендотеліоцитами великих артерій та вен, що дає можливість його використання саме як марке ра новоутворених кровоносних судин [3].
Значне місце серед негативних регуляторів ангіо
генезу займає білок р53, який окрім своїх безпосе редніх функцій пухлинного супресора та «охорон ця геному» відіграє важливу роль у регуляції нео ангіогенезу, оскільки активує експресію інгібіторів ангіогенезу. До останніх належать тромбоспонди ни1, 2, ангіостатин, ендостатин, вазостатин та інші, що запобігають росту кровоносних судин [4]. Поряд з цим білок р53 може опосередковано регулю вати експресію VEGF як через протоонкоген c-Src, так і при безпосередній взаємодії з транскрипцій ним фактором Sp1, перешкоджаючи таким чином активації промотора цього гена. Показано, що му таційні зміни гена ТР53 призводять до одночасного
підвищення експресії c-Src та мРНК VEGF у хворих на рак молочної залози, товстого кишечнику і рак яєчника (РЯ) [5].
Розглядаючи особливості неоангіогенезу пухлин яєчника, слід відзначити, що на сьогодні це питан ня ще недостатньо досліджене. Зокрема, показано певний зв’язок експресії р53 і маркерів ангіогене зу з прогнозом перебігу процесу при І стадії РЯ [6]. Відомостей щодо прогностичної ролі цих маркерів при більш пізніх стадіях захворювання в доступній літературі ми не знайшли. Крім того, не одностай ною є оцінка значення ЩМС для перебігу РЯ. Так, на думку одних дослідників, активація ангіогенезу у новоутвореннях яєчника супроводжується підви щеною здатністю пухлини до швидкого росту, інва зії та метастазування [7]. Інші автори, навпаки, вва жають фактором несприятливого прогнозу РЯ низь ку ЩМС у зв’язку з гіпоксією пухлини, яка виникає в цьому випадку і зумовлює надзвичайну агресив ність останньої [8].
Мета роботи полягала у зіставленні експресії р53 та VEGF, а також ЩМС у серозних новоутвореннях яєчника з клінічними характеристиками (вік, стадія захворювання) та тривалістю життя хворих.
ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження було виконано на операційному ма теріалі 46 хворих на РЯ віком 36–74 роки (середній вік становив 48,2 ± 7,3 року). Усі хворі були розподілені на дві вікові групи: група І – ≤ 45 років (репродуктив ний вік) — 20 (43,5%) пацієнток, група ІІ — > 45 ро ків — 26 (56,5%); у групу ІІ увійшли пацієнтки в пе рименопаузальний та менопаузальний період. При аналізі результатів враховували стадію захворювання за FIGO та виживаність хворих після операції. Ці дані отримували при вивченні історій хвороби та амбула торних карт пацієнток. Усі пацієнтки одержували лі
кування в період з 1988 по 2007 р. у відділенні онкогі некології (керівник – докт. мед. наук, проф. Л.І. Во робйова) Інституту онкології АМН України (нині ДУ «Національний інститут раку»). Неоад’ювантну терапію у обстежених хворих не проводили.
Морфологічну верифікацію діагнозу здійснюва ли шляхом дослідження гістологічних препаратів, за барвлених гематоксиліном та еозином. Імуногістохі мічне виявлення р53 і маркерів ангіогенезу проводили на паралельних депарафінованих зрізах з використан ням відповідних МкАТ та системи візуалізації («Dako Cytomation», Данія): МкАТ до р53, клон DO7; VEGF, клон VG1; CD34, клон QBEnd10. Для візуалізації за стосовували систему EnVision; забарвлення здійсню вали за допомогою хромогену3діамінобензидину тетрахлориду. Ядра клітин дофарбовували гематок силіном Майєра. У кожному випадку аналізували по 600–1000 пухлинних клітин. Результати імуногістохі мічної реакції по виявленню VEGF та p53 оцінювали напівкількісним методом шляхом визначення кіль кості позитивно забарвлених клітин — індекс мітки (ІМ, %). Для оцінки ЩМС у пухлинах яєчника під раховували кількість забарвлених судин в 10 полях зору (розмір одного поля зору обмежувався вимірю вальною квадратною сіткою зі стороною 0,79 мм) з наступним визначенням їх числа на площі 1 мм2 за формулою: ЩМС = n/0,625 мм2, де n — середня кількість судин на одне поле зору; 0,625 мм2 — пло ща одного поля зору.
Аналіз отриманих результатів проводили ме тодом описової статистики, порівняння вибірок (Uкритерій Манна — Уїтні) — за допомогою про грами STATISTICA 6. Достовірними вважали від мінності при р < 0,05. Аналіз виживаності прово дили за допомогою методу Каплана — Майєра, до стовірність відмінностей між кривими виживаності визначали за Coxтестом [9].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Імуногістохімічне дослідження експресії білків р53 та VEGF показало, що експресію р53 (винят ково ядерну) відзначали у 94% пухлин; VEGF вияв ляли лише у цитоплазмі у 67% новоутворень. CD34 експресували плазматичні мембрани ендотеліоци тів; CD34+судини були виявлені в усіх дослідже них пухлинах.
Зіставлення досліджених показників у хворих з різною стадією РЯ виявило певні закономірнос ті (рис. 1).
Рис. 1. Експресія р53 і VEGF (а) та ЩМС (б) у пухлинах хворих з різними стадіями РЯ
Експресія р53 практично не залежала від стадії за хворювання (ІМ становив 35,2 ± 0,5% при І–ІІ ст. РЯ та 36,4 ± 0,5% — при ІІІ–IV ст.), тоді як експре сія VEGF була майже удвічі вищою у пухлинах хво рих з III–IV ст. порівняно з такою при І–II ст. РЯ (16,5 ± 0,3 проти 9,0 ± 0,8%, р < 0,05). Аналогічним чином, але менш виразно, змінювалася ЩМС: спо стерігали тенденцію до її підвищення у пухлинах хворих з ІІІ–IV ст. РЯ (72,5 ± 3,8 проти 64,7 ± 3,5 су дин/мм2 при РЯ І–ІІ ст., р > 0,05) (див. рис. 1).
При аналізі маркерів васкуляризації залежно від збереження менструальної функції пацієнток (не залежно від віку) встановлено, що у жінок у мено паузальний період ЩМС (58,1 ± 3,1 судин/мм2) та експресія VEGF (7,0 ± 0,4%) були вірогідно ниж чими (р < 0,05), ніж у пацієнток зі збереженою менструальною функцією (відповідно 76,4 ± 5,2 су дин/мм2 та 17,0 ± 0,2%). Виявлена розбіжність може бути пов’язана з підвищеним рівнем у жінок ре продуктивного віку стероїдних гормонів (зокрема естрогенів), які згідно з даними літератури акти вують експресію гена VEGF [11, 12]. У той же час у хворих у менопаузальний період виявлено біль шу експресію р53 (38,2 ± 0,6 проти 34,3 ± 0,5%,
р < 0,05) (рис. 2 ).
Рис. 2. Експресія р53 та VEGF у хворих на РЯ залежно від стану менструальної функції
При зіставленні тривалості життя хворих піс ля операції з експресією досліджених маркерів та ЩМС встановлено, що у хворих, які прожили 5 і менше років, експресія р53 і VEGF, а також ЩМС були вірогідно вищими порівняно з такими у хво рих, які прожили більше 5 років (табл. 1).
Таблиця 1 Експресія р53, VEGF та ЩМС у пухлинах хворих з різною
тривалістю життя
Тривалість життя | Експресія | ЩМС, судин/мм2 | |
р53, ІМ, % | VEGF, ІМ, % | ||
Більше 5 років | 30,2 ± 0,2 | 13,3 ± 0,6 | 44,8 ± 4,3 |
5 років і менше | 37,8 ± 0,8* | 21,3 ± 0,3* | 67,5 ± 4,1* |
*р < 0,05.
Отримані дані співпадають з результатами ін ших дослідників, згідно з якими при низькій ЩМС у епітеліальних злоякісних пухлинах яєчника 5річ на виживаність пацієнток збільшується незалежно від стадії захворювання [10].
Ми провели також порівняльний аналіз дослі джених показників, враховуючи одночасно вік па цієнток та термін їх життя після операції (табл. 2).
Таблиця 2 Експресія р53,VEGF та ЩМС у пухлинах хворих на РЯ залежно
від віку та термінів виживаності пацієнтів
Тривалість життя | Вік пацієнток, роки | Досліджені показники | ||
р53, ІМ, % | VEGF, ІМ, % | ЩМС, судин/мм2 | ||
Більше 5 років | ≤ 45 | 29,2 ± 0,5** | 12,3 ± 0,4** | 59,9 ± 4,6 |
> 45 | 35,3 ± 0,5 | 6,5 ± 0,2 | 58,0 ± 4,5 | |
5 років і менше | ≤ 45 | 37,1 ± 0,6*, ** | 23,2 ± 0,7*, ** | 79,5 ± 5,8* |
> 45 | 41,0 ± 0,6* | 12,3 ± 0,4* | 60,3 ± 6,5 |
*р < 0,05 у межах однієї вікової групи залежно від тривалості життя;
**р < 0,05 у межах однієї градації тривалості життя залежно від віку пацієнток.
Такому аналізу передувало визначення вижива ності хворих залежно від віку. Було встановлено, що 5річна виживаність пацієнток, які захворіли у віці старше 45 років (група ІІ) складала 47%, у той час як у хворих репродуктивного віку (група І) лише 18% (р = 0,02) (рис. 3).
Рис. 3. Криві виживаності хворих на РЯ залежно від віку пацієнток
При цьому в групі ІІ експресія VEGF та ЩМС становила в середньому 13,9 ± 0,5% та 62,6 ± 3,9 су дин/мм2, а у групі І відповідно 18,4 ± 0,4% (p < 0,05) та 64,4 ± 4,1 судин/мм2 (p > 0,05).
Як видно з табл. 2, у пухлинах хворих репродуктив ного віку (≤ 45 років), які прожили після операції біль ше 5 років, експресіяр53 буладостовірнонижчою, ніж у хворих, тривалість життя яких не перевищувала 5 ро ків (29,2 ± 0,5 проти 37,1 ± 0,6%, p < 0,05). У хворих віком старше 45 років відзначали аналогічну законо мірність: експресія р53 була нижчою у пацієнток, що прожили більше 5 років (35,3 ± 0,5 проти 41,0 ± 0,6%, p < 0,05 відповідно). У той же час аналіз у межах однієї градації тривалості життя показав, що як у групі паці єнток, які прожили більше 5 років, так і у групі з три валістю життя 5 і менше років експресія р53 була до стовірно нижчою у хворих віком до 45 років порівняно з такою у пацієнток старше 45 років. Експресія VEGF незалежно від вікової групи (до 45 або старше 45 ро ків) була достовірно нижчою у хворих, термін життя яких не перевищив 5 років: в 1,9 раза при обох варіан тах порівняння. При аналізі залежності цього показ ника від віку пацієнток у межах однієї градації трива лості життя виявилося, що в обох випадках експресія VEGF у пухлинах хворих віком старше 45 років була достовірно нижчою за таку у хворих віком до 45 років (при тривалості життя більше 5 років — 6,5 ± 0,2 проти
12,3 ± 0,4% (p < 0,05), 5 років і менше — 12,3 ± 0,4 про ти 23,2 ± 0,7% (p < 0,05) відповідно). ЩМС у пухлинах хворих віком до 45 років, які прожили 5 років і менше, буладостовірновищою, ніжухвориханалогічноговіку, тривалість життя яких перевищила 5 років; у хворих ві ком старше 45 років достовірна різниця ЩМС залеж но від тривалості життя була відсутня. Не виявлено та кож вірогідної різниці показників ЩМС у пацієнток різних вікових груп у межах однієї градації тривалості життя. За сукупністю результатів, наведених в табл. 2, можливо підсумувати, що: 1 — за умови більш висо кого рівня експресії досліджених маркерів тривалість життя пацієнток була меншою; 2 — незалежно від три валості життя експресія VEGF і показник ЩМС були вищими у пацієнток віком до 45 років, експресія р53, навпаки, у пацієнток віком старше 45 років.
Аналіз індивідуальних даних про тривалість життя пацієнток дозволив визначити медіану ЩМС, що має прогностичне значення та може бути точкою розподі лу хворих на прогностичні групи. Медіана (при града ції виживаності — більше 5 років або 5 років і менше) дорівнювала 59,0 судин/мм2. У групі хворих, у пухли нах яких ЩМС була меншою за медіану, кумулятивна 5річна виживаність склала 63,0% і була вірогідно біль шою порівняно з такою 51,0% (р < 0,05) у групі пацієн ток, у яких ЩМС була вище медіани (рис. 4).
Рис. 4. Криві виживаності хворих на РЯ за Капланом — Майєром (розподіл хворих відповідно медіани ЩМС у пухлинах)
Як можливі механізми підвищення ЩМС у пух линах хворих доцільно згадати, перш за все, поси лену продукцією VEGF, що може бути пов’язана як з гіпоксією новоутворення, так і з підвищенням вмісту макрофагів у пухлинному мікрооточенні [13]; поряд з цим мутаційні зміни генасупересора ТР53 призводять до порушення його інгібуючої дії на VEGF [14, 15].
ВИСНОВКИ
Виявилено залежність експресії р53, VEGF та ЩМС у РЯ від віку хворих та стадії захворювання.
Встановлено, що у хворих, термін життя яких менше 5 років після операції, ЩМС у пухлинах і екс пресія р53 та VEGF були достовірно вищими порів
няно з такими у пухлинах хворих, що були живі піс ля операції більше 5 років.
Показано, що у хворих віком до 45 років екс пресія VEGF та ЩМС вірогідно перевищують такі у пацієнток у менопаузальний період; тенденцію до підвищення експресії р53 виявлено у хворих у ме нопаузальний період.
Загальна безрецидивна виживаність хворих ві ком старше 45 років була вірогідно вищою, що є під ґрунтям для визначення віку хворих як незалежно го фактора прогнозу РЯ.
Комплекс показників, що відображають інтен сивність васкуляризації — ЩМС, експресія VEGF та р53 є перспективними для оцінки перебігу сероз ного РЯ і можуть бути використані в якості прогнос тичних маркерів пухлинного процесу.
ЛІТЕРАТУРА
Канцерогенез / Под ред ДГ Заридзе / Москва: Меди цина, 2004. 576 с.
Pal S, Datta Mukhopadhyay KD. Central Role of p53 on Regulation of Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor (VPF/VEGF) Expression in Mammary Carcinoma. Cancer Res 2001; 61: 6952–7.
Mukhopadhyay D, Tsiokas L, Sukhatme VP. Wildtype p53 and vSrc exert opposing influences on human vascular endothelial growth factor gene expression. Cancer Res 1995; 55: 6161–5.
Michael J, Goodheart M, Rose L, et al. The Relationship of Molecular Markers of p53 Function and Angiogenesis to Prognosis of Stage I Epithelial Ovarian cancer. Clin Cancer Res 2005; 11 (10): 3733–42.
Kohn EC. Аngiogenesis in Ovarian carcinoma. Cancer 1997;
80 (12): 1452–63.
Petzelbauer P, Halama T, Groger M. Endothelial adherens junctions. J Invest Dermatol Symp Proc 2000; 5: 13–21.
Сметник ВП. Системные изменения у женщин в кли мактерии. Рус мед журн 2001; 9 (9): 354–8.
Крючков АН, Фрейд ГГ. Неоангиогенез и плотность сети микрососудов в раке молочной железы. Арх патологии 2008; 70 (1): 62–5.
Ravi R, Mookerjee B, Bhujwalla ZM, et al. Regulation of tumor angiogenesis by p53induced degradation of hypoxia inducible factor 1 alfa. Genes Dev 2000; 14: 34–44.
Черноглазова ЕВ, Дбар ЖН, Степанова ЕВ. Молеку лярные механизмы опухолевого неоангиогенеза. Успехи со врем биол 2004; 124 (5): 480–8.
Brown MR, Blanchette JO, Kohn EC. Angiogenesis in
ovarian cancer. Clin Cancer Res 2000; 14 (6): 901–18.
Bamberger ES, Perrett CW. Angiogenesis in epithelial ovarian cancer. J Clin Pathol 2002; 55: 348–59.
Kaplan EL, Meier PN. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assos 1958; 53: 457–81.
Chan JK, Loizzi V, Lin F, et al. Stages III and IV invasive epithelial ovarian carcinoma in younger versus older women: what prognostic factors are important? Obst Gynecol 2003; 102: 156–61.
Boussat S, Eddahibi S, Coste A, et al. Expression and regulation of vascular endothelial growth factor in human pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000; 279 (2): 371–8.
Без коментарів » Додати коментар