МЕТФОРМІН ЯК МОДИФІКАТОР ОКИСНОГО СТАНУ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ТА ЖИТТЄЗДАТНОСТІ ЛІМФОЦИТІВ ЛЮДИНИ ПІД ДІЄЮ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-22-1-2020-g.8855

Останніми роками намітився певний прогрес у вирішенні проблеми профілактики віддалених стохастичних наслідків опромінення переважно завдяки вивченню і використанню хімічних сполук, що мають радіомітигуючу дію. Радіомітигатори (РМ) знижують шкідливу дію іонізуючого випромінювання на клітини критичних систем організму (передусім гемато-імунної системи) шляхом прискорення відновлення радіочутливих тканин і посилення секреції гемопоетичних ростових факторів [1–3].

Відповідно до сучасних уявлень перспективним для подальшого вивчення механізмів дії РМ є метформін гідрохлорид (МФ), який належить до класу бігуанідів і застосовується при лікуванні пацієнтів із цукровим діабетом ІІ типу [4–6]. Встановлено антиапоптотичну дію МФ та зниження кількості хромосомних аберацій і мікроядер у лімфоцитах периферичної крові (ЛПК) людини після їх опромінення [7]. Подібна дія МФ була показана і при індукованій етанолом дегенерації пренатальних кортикальних нейронів щурів [8], викликаній дією Cd загибелі нейрональних клітин [9], на моделі безалкогольної жирової дегенерації печінки [10]. На мишах лінії C57BI/6J та лінії клітин Н9С2 показано, що МФ також інгібує апоптоз клітин серця [11]. Наслідки впливу МФ на нормальні та пухлинні клітини зазвичай мають протилежний характер, показано його проапоптотичну дію на різних лініях і в культурах ракових клітин людини та експериментальних тварин [12–17].

Застосування МФ у модельних дослідженнях на різних лініях нормальних [18–19] і пухлинних клітин [13, 14, 20, 21] у більшості призводило до пригнічення їх проліферації. У хворих на рак ендометрія та молочної залози, які приймали МФ, було відзначено суттєве зниження рівня ядерного білка KI-67, що асоціюється із проліферацією клітин [22–23].

Показано, що МФ специфічно пригнічує комплекс I дихального ланцюга мітохондрій, знижуючи окиснення НАДФ, швидкість споживання кисню та синтез АТФ з АДФ; активує 5’АМФ‑активовану протеїнкіназу, пригнічує комплекс mTOR і мітоген-­активовані кінази (MAPK), які беруть участь у регуляції процесів біосинтезу білка, енергетичного обміну, проліферації, експресії генів, диференціювання, мітозу, виживання клітин та апоптозу [24–27]. Також у реалізації ефектів МФ задіяні фосфатидилінозитол-3-кіназа, сімейство протеїнкіназ B, c-Jun-N-кінцева кіназа та сигнальні каскади, пов’язані із АФК [16, 28]. Виявлено, що дія МФ на клітини злоякісних новоутворень пов’язана зі значними різноспрямованими змінами експресії низки білків та некодуючих miRNAs [29–30].

МФ значно змінює баланс вільнорадикальних процесів. У результаті інгібування НАДФН‑оксидази зменшується продукція АФК [31], а внаслідок зниження експресії FOXO3 активуються ферменти антиоксидантного захисту: супероксиддисмутаза (СОД) і каталаза (КАТ) [32]. Однак ефекти щодо змін про- та антиоксидантних процесів, що спостерігаються за дії МФ, для нормальних та пухлинних клітин істотно відрізняються. Так, застосування МФ in vitro та in vivo ефективно запобігало апоптотичній загибелі нормальних клітин, індукованій різними чинниками, що супроводжувалося також антиоксидантною дією [9, 19, 33–35]. Водночас у клітинах ліній гепатоцелюлярної карциноми щурів H4II та остеосаркоми U2OS і 143B МФ стимулював напрацювання АФК, проапоптотичні зміни та зупинку клітинного циклу, а застосування антиоксиданта N-ацетилцистеїну нівелювало зазначені ефекти [12, 28]. Показано, що антиоксидантний вплив МФ може знижувати рівень пошкоджень ДНК у результаті дії гідропероксиду кумолу [36], але в дослідженні [37] подібний захисний ефект препарату не виявлений.

Вираженість ефектів МФ залежить від особливостей обмінних процесів в організмі та, зокрема, від обміну глюкози. Так, показано, що при культивуванні кардіоміобластів H9c2 у середовищі з високим вмістом глюкози у разі дії МФ значно покращувався стан клітин: повністю відновлювався рівень АТФ, нормалізувався вміст ліпідів, GSH і рівень утворення АФК, частково відновлювалися рівень поглинання глюкози, інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), активність СОД, поляризація мембран мітохондрій та знижувалася частка фрагментованої ДНК [38]. Для пухлинних клітин, навпаки, показано підвищення їх чутливості до антипроліферативної та проапоптотичної дії МФ і вищу цитотоксичність препарату в разі низького вмісту глюкози або при надмірній масі тіла експериментальних тварин [21, 39].

Показано, що МФ може модифікувати дію іонізуючого випромінювання. За впливу радіації ефекти препарату також відрізняються. Так, МФ знижував негативний вплив радіації на тканини серця щурів, діючи як захисний фактор щодо окисного стресу та ефектів медіаторів запалення та ендотеліальної дисфункції [40]. У разі внутрішньовенного введення мишам радіаційно мічених пептидів МФ значно зменшував їх накопичення в нирках і прискорював їх виведення із сечею. Це може бути перспективним для захисту від нефротоксичності при терапії із застосуванням радіонуклідів [41]. Радіаційно індукована токсичність при проведенні ад’ювантної променевої терапії у жінок на ранній стадії раку молочної залози значно знижувалась у когорти обстежених, які приймали МФ [42]. З іншого боку, в дослідженнях in vivo та in vitro на лініях пухлинних клітин раку прямої кишки, товстої кишки, раку підшлункової залози, карциноми легені показано, що МФ підвищував їх чутливість до опромінення [43–46]. При цьому посилення радіочутливості пухлинних клітин за модифікуючої дії препарату може бути пов’язано з інгібуванням епітеліально-мезенхімального переходу [47], впливом на сигнальний шлях Hedgehog [48] та підвищенням ступеня оксигенації пухлин [49].Найбільш радіочутливими клітинами людини, що визнані біодозиметрами/біоіндикаторами опромінення, є ЛПК [50, 51]. На культурі ЛПК показано, що МФ у концентраціях 12,5–50,0 мкМ не викликав змін у показниках мікроядерного тесту, при визначенні кількості та спектра хромосомних аберацій і не впливав на мітотичний потенціал клітин [52]. Введення МФ експериментальним щурам із гліомою (лінія C6) відновлювало чисельність ЛПК майже до рівня інтактних тварин [53]. На культурі ЛПК здорових чоловіків показано, що МФ збільшував частку життєздатних клітин після впливу радіації, що супроводжувалося значним зменшенням аберацій хромосом, зниженням частоти апоптозу. МФ зменшував викликані дією іонізуючого випромінення зміни експресії генів BAX, CASP3 і BCL2 [54, 55]. Радіозахисні властивості МФ виявлені у хворих на рак щитоподібної залози, які отримували терапію із застосуванням радіоактивного 131I [56]. Водночас, слід зазначити, що залишаються нез’ясованими особ­ливості дії МФ як РМ залежно від його концентрації, дози опромінення та радіочутливості клітин.

Оскільки радіаційно-індуковані біохімічні зміни передують реалізації пошкоджень на генетичному рівні клітин, а надалі підтримують сформовану нестабільність геному, то доцільним є також детальне вивчення особливостей впливу МФ на активність ферментів та процесів, які визначають оксидативний стан периферичної крові людини.

Враховуючи викладене, мета проведеного дослідження — визначити особливості впливу МФ in vitro на трансмембранний потенціал мітохондрій (ТМП), загальну продукцію вільнорадикальних сполук (ВРС) і супероксидного аніона-радикала (О₂^.–) у ЛПК умовно здорових осіб (УЗО), мітотичний потенціал та апоптотичну загибель цих клітин, а також на баланс про- і антиоксидантних процесів та інтенсивність процесів ПОЛ у крові залежно від концентрації МФ і дози опромінення.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідженні використані зразки периферичної крові 37 умовно здорових осіб (19 чоловіків віком від 22 до 41 років та 18 жінок віком від 22 до 58 років), від яких отримано інформовану згоду відповідно до принципів проведення біомедичних досліджень, що викладені в Гельсінській декларації Всесвітньої медичної асоціації. Периферичну кров збирали у стандартні стерильні пробірки Vacutainer об’ємом 6 мл із антикоагулянтом Li‑гепарин. Зразки крові зберігали і транспортували при 3–5 °С.

Розчин МФ (1,1‑Диметилбігуанід гідрохлорид, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) в ізотонічному натрій‑фосфатному буфері із pH 7,4 (PBS) вносили у кров у співвідношенні 1:20 (фінальна концентрація 2 або 20 мМ, тривалість інкубації 1 год при 19–21 °С). Тест-опромінення крові (дози 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 Гр) проводили через 1 год після внесення МФ на рентгенівському апараті РУМ‑17. Умови опромінення: напруга на трубці — 180 кВ, струм — 10 мА, фільтр — 0,5 мм Cu + 1 мм Al, шкірно-фокусна відстань — 50 см, потужність дози опромінення — 0,55 Гр/хв.

Виділення плазми крові та ЛПК і підрахунок кількості клітин. Плазму крові отримували центрифугуванням (15 хв при 1500 об./хв; 19–21 °С) і зберігали при –20 °С. Виділення ЛПК виконували з використанням ГІСТОПАК‑1077 HYBRI‑MAX згідно з інструкцією виробника (BioReagent) [57]. Підрахунок кількості життєздатних клітин проводили за стандартною методикою, використовуючи суправітальне фарбування трипановим синім (Sigma) [58].

Прооксидантно-антиоксидантне співвідношення (ПАС) у крові визначали у гемолізатах (кров розведена дистильованою водою у 400 разів) методом індукованої пероксидом водню хемілюмінесценції (ХЛ) [59] із модифікаціями [60] на приладі AutoLumat LB 953 (Germany). До 0,6 мл гемолізату додавали 50 мкл 10 % розчину Н₂О₂ і вимірювали ХЛ упродовж 180 с (18 вимірів з інтервалом 10 с). Дані виражали в імпульсах (імп.) за 180 с (імп./180 с).

Інтенсивність ПОЛ оцінювали за концентрацією його кінцевого продукту — малонового диальдегіду (МДА) в плазмі крові. Вміст визначали за утворенням забарвленого триметинового комплексу з 2‑тіобарбітуровою кислотою [61, 62]. Вимірювання забарвлення проводили у 1 см кварцевій кюветі при довжині хвилі 532 нм на спектрофотометрі Agilent 8453 (США). При проведенні розрахунків використовували молярний коефіцієнт екстинкції МДА (ε=1,56 ∙ 10⁵ см^-1 ∙ моль^-1) та перераховували його вміст на кількість білка. Концентрацію білка визначали за методом Greenberg [63]. До 2 мл розведеної дистильованої води у 200 разів плазми крові додавали 1 мл реактиву Greenberg та через 15–20 хв проводили вимірювання інтенсивності забарвлення з використанням фотоелектро-калориметра (довжина хвилі 590 нм, кювета 0,5 см). Як контроль використовували зразок із дистильованою водою замість дослідного зразка. Розрахунки проводили згідно з калібрувальною кривою з використанням стандартних розчинів білка.

Інтенсивність генерування О2.– ЛПК оцінювали ХЛ методом, що базується на використанні індикатора люцигеніну, який реагуючи з О₂^.– висвічує кванти світла [64]. Зразок для вимірювань містив 40 мкл 0,05% люцигеніну та 1 мл суспензії клітин у PBS (1 млн/мл). Вимірювання проводили на приладі AutoLumat LB 953 (Germany) упродовж 72 с (18 вимірів з інтервалом у 4 с). Дані виражали в імп. за 72 с (імп./72 с).

Інтенсивність напрацювання ВРС визначали з використанням флуоресцентного зонда дихлоро-флуоресцеїн-діацетату (DCFH-DA), що дає можливість оцінити загальний рівень утворення активних форм кисню та азоту [65, 66]. Вимірювання флуоресценції (l_ex = 485 нм, l_em = 528 нм) проводили у 96-лункових чорних планшетах (кожні 7,5 хв упродовж 90 хв при 37 °С) з використанням рідера Sinergy НТ (США). Вміст лунки: 100 мкл суспензії клітин (1 млн/мл), 150 мкл PBS та 50 мкл розчину DCFH‑DA у збалансованому сольовому розчині (фінальна концентрація — 50 мкМ). Для підрахунків використовували період 30–90 хв. Результати перераховували у мМ пероксиду водню на 1000 кл. за год (мМ/тис. кл./год) за калібрувальною кривою.

Для визначення ТМП використовували барвник JC‑1 згідно з деякими модифікаціями. До 0,5 мл суспензії [67, 68] ЛПК (1,0 млн/мл) додавали 5 мкл 1 мМ розчину JC‑1 у ДМСО та інкубували клітини 20–25 хв при 37 °С у темряві. Двічі відмивали клітини від залишків барвника 2,5 мл PBS з подальшим центрифугуванням 10 хв при 1000 об./хв та доводили їх концентрацію до 0,5 млн/мл. Вимірювання проводили з використанням рідера Sinergy НТ (США) у 96-лункових чорних планшетах при внесенні у лунки 100 мкл суспензії клітин (l_ex = 485 нм, l_em = 528 нм та l_em = 590 нм). Контролем слугували інтактні клітини без забарвлення. Рівень ТМП підраховували за співвідношенням J‑агрегатів та J‑мономерів (інтенсивності червоної (l_em = 590 нм) та зеленої (l_em = 528 нм) флуоресценції клітин).

Вміст гіподиплоїдних клітин у зразках ЛПК визначали методом проточної цитометрії [69]. Для проведення аналізу клітини інкубували 30 хв у розчині пропідія йодиду (5 мкг/мл, Sigma, США) з 0,1 % цитратом натрію та 0,1% тритоном X‑100 при температурі 19–21 °С. Для запобігання зв’язування пропідію йодиду з РНК в інкубаційну суміш додавали РНКазу А без ДНКази (Rnase A, DNase-free, activity — min 90 units/mg, Neo Froxx, Німеччина) в кінцевій концентрації 250 мкг/мл. Флуоресценцію клітин оцінювали з використанням проточного цитофлуориметра Beckman Coulter EPICS XL (Beckman Coulter, США). У кожній пробі підраховували не менш ніж 10 тис. клітин. Мертві клітини та їх фрагменти не враховували. Для кількісного аналізу даних застосовували програму CELLQuest («BD Biosciences Pharmingen», США).

З метою оцінки проліферативного потенціалу ЛПК у заданих експериментальних умовах визначали мітотичний індекс (МІ) мітоген-стимульованих (Phytohemagglutinin M-form (Gibko, USA), 0,1–0,15 мл/мл крові) лімфоцитів на підставі формули [70]:

МІ = (М₁/М₂) ∙ 1000 ‰,

де М₁ — кількість клітин у стадії метафази, М₂ — загальна кількість бластних клітин (рис. 1).

З метою зменшення величини стандартної помилки аналізували не менш як 2000 клітин на одне спостереження [71].

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програм «MS Excel» та «OriginPro 2015». Підраховували стандартні статистичні показники. Достовірність відмінностей визначали із використанням t-критерію Student та парного рангового критерію Wilcoxon. Різницю між одержаними показниками вважали достовірною при р ≤ 0,05 [72].

Результати та їх обговорення

Вплив МФ на інтенсивність утворення реактивних сполук у ЛПК оцінювали за напрацюванням О₂^.– та загальним рівнем продукції ВРС. Також оцінювали зміни ТМП цих клітин, оскільки цей показник пов’язаний зі змінами енергетичного стану клітин, інтенсивністю окисно-відновних реакцій. За вибраних у дослідженні умов не виявлено впливу МФ на інтенсивність напрацювання ВРС як у неопромінених ЛПК, так і після тест-опромінення. Спостерігали лише тенденцію до зниження рівня утворення О₂^.– у неопромінених ЛПК (у 1,64 раза) за дії МФ в концентрації 2 мМ, а також при внесенні препарату в концентрації 20 мМ з подальшим тест-опроміненням крові у дозах 1,0 та 2,0 Гр (в 1,47 раза для обох доз) (табл. 1). Зміни ТМП у ЛПК після інкубації зразків крові із МФ також не були достовірними. За концентрації препарату 2 мМ спостерігали тенденцію до зниження цього показника для всіх варіантів досліду як із тест-опроміненням зразків крові, так і без. МФ у концентрації 20 мМ не змінював показник ТМП в неопромінених клітинах, дещо підвищував його при опроміненні ЛПК в дозах 0,5 і 3,0 Гр та знижував при опроміненні в дозах 1,0–2,0 Гр (в 1,70 і 1,80 раза відповідно).

*Достовірні відмінності (p ≤ 0,05) між зразками крові із МФ у концентраціях 2 та 20 мМ.

Вплив МФ на стан окисних процесів у крові оцінювали за змінами ПАС та інтенсивністю процесів ПОЛ (концентрація МДА у плазмі крові). Результати впливу МФ на вміст МДА та ПАС у крові представлено в табл. 2. Введення МФ у зразки крові не призводило до достовірних змін ПАС та вмісту МДА у крові, але спостерігалася тенденція до зниження концентрації МДА (у 1,67 раза) за введення у кров МФ у концентрації 2 мМ. Після опромінення крові цей ефект також був більш вираженим за нижчої концентрації МФ. Максимальне зниження за дози опромінення 2,0 Гр визначено при дії обох концентрацій МФ (2 мМ і 20 мМ). Зміни ПАС під дією МФ були практично відсутні (див. табл. 2). Можна лише відзначити тенденцію до зниження ПАС у 1,22 раза при застосуванні препарату в нижчій концентрації. Аналогічний ефект дії МФ (за обох концентрацій препарату) спостерігався при тест-опроміненні крові у максимальній із застосованих доз — 3,0 Гр.

*Достовірні відмінності (p ≤ 0,05) від групи без тест-опромінення; **достовірні відмінності (p ≤ 0,05) від групи із тест-опроміненням 0,5 Гр.

Вивчення впливу МФ на стан ЛПК in vitro показало, що рівень проліферативної активності неопромінених ЛПК становив 69,1 ± 1,2‰, що відповідає сучасним даним [71]. Спостерігали дозозалежне пригнічення мітотичної активності клітин у всьому дослідженому діапазоні доз порівняно з контрольними значеннями: 0,5 Гр — в 1,48; 1,0 Гр — в 1,66; 2 Гр — в 2,06; 3,0 Гр — в 2,65 раза. Отримані дані відповідають основним положенням класичної радіобіо­логії, відображаючи радіаційно-індуковану імунодепресію «індикаторних» клітин (рис. 2). Дослідження імовірної активності МФ як РМ показало, що при додаванні препарату в культуру ЛПК перед тест-опроміненням спостерігається зниження мітотичної активності опромінених клітин у всьому дослідженому діапазоні доз. Такий ефект був найбільш вираженим за концентрації МФ 20 Мм та дозі опромінення 3,0 Гр. Зазначимо також факт зниження при дії МФ мітотичної активності неопромінених клітин. Таким чином, за умов нашого дослідження показано, що МФ пригнічує відповідь ЛПК на мітоген, тобто не одержано свідчень його радіомітигуючої дії.

Значні зміни спостерігали щодо апоптотичної загибелі ЛПК за впливу МФ. Інкубація зразків крові із МФ призводила до достовірного підвищення частки клітин у стані апоптозу (рис. 3). Для інтактних зразків крові середня частка ЛПК у стані апоптозу становила 1,89 ± 0,40%, а після інкубації із МФ зростала у 2,30 раза за концентрації препарату 2 мМ та у 1,83 раза — за концентрації 20 мМ. Подальше опромінення зразків крові істотно не змінювало ефекту впливу МФ, який залишався більш вираженим для нижчої із використаних концентрацій препарату.

В описаному дослідженні показано, що короткотривала інкубація зразків ЛПК із МФ у концентраціях 2,0 та 20,0 мМ значно знижувала мітотичний індекс та збільшувала кількість клітин у стані апоптозу, що суперечить результатам досліджень, в яких показано захисну дію МФ на нормальні клітини (у тому числі ЛПК) [11, 54]. У низці досліджень цей ефект МФ спостерігали лише для пухлинних клітин [12, 13, 15]. В окремих публікаціях описано відсутність впливу МФ на мітотичний потенціал ЛПК та відсутність генетичних пошкоджень цих клітин [52]. У публікації [19] описано можливість підсилення апоптозу лімфоцитів за впливу МФ, причому збільшення частки клітин у стані апоптозу відбувалося на фоні зниження інтенсивності ПОЛ та підвищення вмісту GSH. Проапоптотичний ефект препарату може бути пов’язаний із інгібуванням гена p16Ink4a, що підтримує життєздатність старіючих клітин, перешкоджаючи їх апоптозу [73].

В умовах проведених експериментів показано (на рівні тенденції) вплив МФ на інтенсивність окисних процесів у крові, зокрема на продукцію реактивних сполук у ЛПК та ТМП цих клітин. Ці результати є попередніми та потребують подальшого накопичення експериментального матеріалу у зв’язку зі значними індивідуальними відмінностями у початкових рівнях досліджених показників та ступенем їх змін у відповідь на внесення МФ та проведення тест-опромінення. Загалом виявлені зміни свідчать про зниження вільнорадикального навантаження у крові за впливу препарату. Відзначимо, що внесення в інтактну кров МФ у концентрації 2 мМ викликало більш інтенсивні зміни вмісту МДА та напрацювання О₂^.–. За тест-опромінення крові в дозах 1,0 та 2,0 Гр більш виражені зміни цих показників спостерігали при застосуванні вищої концентрації препарату (20 мМ). У дослідженні [54] також було показано, що найбільший цитопротекторний ефект МФ спостерігається за дози опромінення 2,0 Гр, що є типовою дозою при проведенні променевої терапії, яка викликає пошкодження ДНК та мутації [74].

Таким чином, сукупність отриманих результатів не дозволяє однозначно зробити висновок про дію МФ як РМ. Проте достатньо аргументує доцільність подальших комплексних досліджень, спрямованих на визначення найбільш ефективних умов застосування препарату МФ при терапевтичному опроміненні хворих онкологічного профілю.

Висновки

1. Препарат МФ не змінював загального рівня утворення ВРС у ЛПК, але тенденції до зниження напрацювання цими клітинами О₂^.–, зменшення вмісту в крові МДА та зниження ПАС свідчать про можливість застосування препарату як модифікатора вільнорадикальних процесів. Більш виражені ефекти дії МФ спостерігали в інтактних ЛПК за концентрації 2 мМ, при опроміненні зразків — за концентрації 20 мМ.

2. МФ у системі in vitro пригнічував мітотичну активність ЛПК та підвищував рівень їх апоптотичної загибелі до та після тест-опромінення в діапазоні доз 0,5–3,0 Гр.

3. Отримані результати можуть скласти підґрунтя для дослідження радіозахисних ефектів МФ в немалігнізованих клітинах хворих онкологічного профілю.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

• 1. Hall EJ, Giaccia AJ. Radiobiology for the radiologist. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2006. 546 p.
• 2. Vasin MV. Classification of antitumor agents as a reflection of the current state and prospects of development of radiation pharmacology. Radiation biology. Radioecology 2013; 63 (5): 459–67 (in Russian).
• 3. Domina EA. Anty-radiation means: classification and mechanisms. Problems of radiation medicine and radiobiology 2015; 20: 42–54.
• 4. Mohan V, Cooper ME, Matthews DR, et al. The standard of care in type 2 diabetes: re-evaluating the treatment paradigm. Diabetes Ther 2019; 10 (1): 1–13.
• 5. Bin Hussain AK, Abdelgadir E, Rashid F, et al. Should metformin still be the first-line of treatment in type 2 diabetes mellitus? A comprehensive review and suggested algorithm. Diabetes Metab Syndr 2019; 13 (3): 1935–42.
• 6. Madsen KS, Chi Y, Metzendorf MI, et al. Metformin for prevention or delay of type 2 diabetes mellitus and its associated complications in persons at increased risk for the development of type 2 diabetes mellitus. Cochrane Database Syst Rev 2019; 12: CD008558.
• 7. Cheki M, Shirazi A, Mahmoudzadeh A, et al. The radioprotective effect of metformin against cytotoxicity and genotoxicity induced by ionizing radiation in cultured human blood lymphocytes. Mutat Res 2016; 809: 24–32.
• 8. Ullah I, Ullah N, Naseer MI, et al. Neuroprotection with metformin and thymoquinone against ethanol-induced apoptotic neurodegeneration in prenatal rat cortical neurons. BMC Neurosci 2012; 13 (11). doi: 10.1186/1471-2202-13-11.
• 9. Chen X, Wu W, Gong B, et al. Metformin attenuates cadmium-induced neuronal apoptosis in vitro via blocking ROS-dependent PP5/AMPK-JNK signaling pathway. Neuropharmacology 2020; Mar. 21: 108065. doi: 10.1016/j.neuropharm.2020.108065.
• 10. Wu PB, Song Q, Yu YJ, et al. Effect of metformin on mitochondrial pathway of apoptosis and oxidative stress in cell model of nonalcoholic fatty liver disease. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi; 28 (1): 64–8 (in Chinese).
• 11. Loi H, Boal F, Tronchere H, et al. Metformin protects the heart against hypertrophic and apoptotic remodeling after myocardial infarction. Front Pharmacol 2019; 10: 9 р.
• 12. Park D. Metformin induces oxidative stress-mediated apoptosis without the blockade of glycolysis in H4IIE hepatocellular carcinoma cells. Biol Pharm Bull 2019; 42 (12): 2002–8.
• 13. Lee J., Hong EM, Kim JH, et al. Metformin induces apoptosis and inhibits proliferation through the AMP-activated protein kinase and insulin-like growth factor 1 receptor pathways in the bile duct cancer cells. J Cancer 2019; 10 (7): 1734–44.
• 14. Ye J, Qi L, Chen K, et al. Metformin induces TPC-1 cell apoptosis through endoplasmic reticulum stress-associated pathways in vitro and in vivo. Int J Oncol 2019; 55 (1): 331–9.
• 15. Yudhani RD, Astuti I, Mustofa M, et al. Metformin modulates cyclin D1 and P53 expression to inhibit cell proliferation and to induce apoptosis in cervical cancer cell lines. Asian Pac J Cancer Prev 2019; 20 (6): 1667–73.
• 16. Chen HL, Ma P, Chen YL, et al. Effect of metformin on proliferation capacity, apoptosis and glycolysis in K562 cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2019; 27 (5): 1387–94 (in Chinese).
• 17. Bruno S, Ledda B, Tenca C, et al. Metformin inhibits cell cycle progression of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Oncotarget 2015; 6 (26): 22624–40.
• 18. Zhou DM, Ran F, Ni HZ, et al. Metformin inhibits high glucose-induced smooth muscle cell proliferation and migration. Aging (Albany NY) 2020; 12 (6): 5352–61.
• 19. Solano ME, Sander V, Wald MR, et al. Dehydroepiandrosterone and metformin regulate proliferation of murine T lymphocytes. Clin Exp Immunol 2008; 153 (2): 289–96.
• 20. Yamana H, Kato K, Kobara H, et al. Metformin inhibits proliferation and tumor growth of QGP-1 Pancreatic neuroendocrine tumor cells by inducing cell cycle arrest and apoptosis. Anticancer Res 2020; 40 (1): 121–32.
• 21. Guo H, Kong W, Zhang L, et al. Reversal of obesity-driven aggressiveness of endometrial cancer by metforminю Am J Cancer Res 2019; 9 (10): 2170–93.
• 22. Petchsila K, Prueksaritanond N, Insin P, et al. Effect of metformin for decreasing proliferative marker in women with endometrial cancer: a randomized double-blind placebo-controlled trial. Asian Pac J Cancer Prev 2020; 21 (3): 733–41.
• 23. Min W, Wang B, Guo A, et al. The Effect of metformin on the clinicopathological features of breast cancer with type 2 diabetes. World J Oncol 2020; 11 (1): 23–32.
• 24. Bridges HR, Jones AJ, Pollak MN, et al. Effects of metformin and other biguanides on oxidative phosphorylation in mitochondria. Biochem J. 2014; 462: 475–87.
• 25. Wheaton WW, Weinberg SE, Hamanaka RB, et al. Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis. Elife (Cambridge) 2014; 3: e02242: 18 р.
• 26. Yu X, Mao W, Zhai Y, et al. Anti-tumor activity of metformin: from metabolic and epigenetic perspectives. Oncotarget 2017; 8 (3): 5619–28.
• 27. Chen J, Zhang S, Pan G, et al. Modulatory effect of metformin on cardiotoxicity induced by doxorubicin via the MAPK and AMPK pathways. Life Sci 2020; 249: 117498: 11 р.
• 28. Li B, Zhou P, Xu K, et al. Metformin induces cell cycle arrest, apoptosis and autophagy through ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma. Int J Biol Sci 2020; 16 (1): 74–84.
• 29. Xia C, Yang F, He Z, et al. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of the inhibition of cervical cancer cell invasion and migration by metformin. Biomed Pharmacother 2020; 123: 109762: 9 р.
• 30. Yamashita T, Kato K, Fujihara S, et al. Anti-diabetic drug metformin inhibits cell proliferation and tumor growth in gallbladder cancer via G0/G1 cell cycle arrest. Anticancer Drugs 2020; 31 (3): 231–40.
• 31. Zhou J, Massey S, Story D, et al. Metformin: an old drug with new applications. Int J Mol Sci 2018; 19 (10): pii: E2863: 15 р.
• 32. Kim JM, Yoo H, Kim JY, et al. Metformin alleviates radiation-induced skin fibrosis via the downregulation of FOXO3. Cell Physiol Biochem 2018; 48 (3): 959–70.
• 33. Ozbey G, Nemutlu-Samur D, Parlak H, et al. Metformin protects rotenone-induced dopaminergic neurodegeneration by reducing lipid peroxidation. Pharmacol Rep 2020. Mar 23. doi: 10.1007/s43440-020-00095-1.
• 34. Man’cheva TA, Demidov DV, Plotnikova NA, et al. Melatonin and metformin inhibit skin carcinogenesis and lipid peroxidation induced by benz(a)pyrene in female mice. Bull Exp Biol Med 2011; 151 (3): 363–5.
• 35. Wang HW, Lai EH, Yang CN, et al. Intracanal metformin promotes healing of apical periodontitis via suppressing inducible nitric oxide synthase expression and monocyte recruitment. J Endod 2020; 46 (1): 65–73.
• 36. Kanigür‑Sultuybek G, Ozdas SB, Curgunlu A, et al. Does metformin prevent short-term oxidant-induced dna damage? In vitro study on lymphocytes from aged subjects. J Basic Clin Physiol Pharmacol 2007; 18 (2): 129–40.
• 37. Onaran I, Guven GS, Ozdaş SB, et al. Metformin does not prevent DNA damage in lymphocytes despite its antioxidant properties against cumene hydroperoxide-induced oxidative stress. Mutat Res 2006; 611 (1–2): 1–8.
• 38. Johnson R, Sangweni NF, Mabhida SE, et al. An in vitro study on the combination effect of metformin and N-Acetyl cysteine against hyperglycaemia-induced cardiac damage. Nutrients 2019; 11 (12) pii: E2850: 19 р.
• 39. Kadoda K, Moriwaki T, Tsuda M, et al. Selective cytotoxicity of the anti-diabetic drug, metformin, in glucose-deprived chicken DT40 cells. PLoS One 2017; 12 (9): e0185141: 11 р.
• 40. Karam HM, Radwan RR. Metformin modulates cardiac endothelial dysfunction, oxidative stress and inflammation in irradiated rats: A new perspective of an antidiabetic drug. Clin Exp Pharmacol Physiol 2019; 46 (12): 1124–32.
• 41. Xiong C, Yin D, Li J, et al. Metformin reduces renal uptake of radiotracers and protects kidneys from radiation-induced damage. Mol Pharm 2019; 16 (2): 808–15.
• 42. Yu JM, Hsieh MC, Qin L, et al. Metformin reduces radiation-induced cardiac toxicity risk in patients having breast cancer. Am J Cancer Res 2019; 9 (5): 1017–26.
• 43. Park JH, Kim YH, Park EH, et al. Effects of metformin and phenformin on apoptosis and epithelial-mesenchymal transition in chemoresistant rectal cancer. Cancer Sci 2019; 110 (9): 2834–45.
• 44. Brown SL, Kolozsvary A, Isrow DM, et al. A novel mechanism of high dose radiation sensitization by metformin. Front Oncol 2019; 9 (Art 247): 8 p.
• 45. Riaz MA, Sak A, Erol YB, et al. Metformin enhances the radiosensitizing effect of cisplatin in non-small cell lung cancer cell lines with different cisplatin sensitivities. Sci Rep 2019; 9 (1): Art 1282: 16 р.
• 46. Fasih A, Elbaz HA, Hüttemann M, et al. Radiosensitization of pancreatic cancer cells by metformin through the AMPK pathway. Radiat Res 2014; 182 (1): 50–9.
• 47. Zhang KF, Wang J, Guo J, et al. Metformin enhances radiosensitivity in hepatocellular carcinoma by inhibition of specificity protein 1 and epithelial-to-mesenchymal transition. J Cancer Res Ther 2019; 15 (7): 1603–10.
• 48. Gonnissen A, Isebaert S, McKee CM, et al. The effect of metformin and GANT61 combinations on the radiosensitivity of prostate cancer cells. Int J Mol Sci 2017; 18 (2) pii: E399: 15 р.
• 49. Zannella VE, Dal Pra A, Muaddi H, et al. Reprogramming metabolism with metformin improves tumor oxygenation and radiotherapy response. Clin Cancer Res 2013; 19 (24): 6741–50.
• 50. Domina EA. Radiogenic cancer: epidemiology and primary prevention. Kiyv: Naukova Dumka, 2016. 196 p. (in Russian).
• 51. Grinevich YuA, Domina EA. Immune and cytogenetic effects of dense and rarely ionizing radiation. Kiev: Zdorov’ya, 2006. 200 p. (in Russian).
• 52. Sant’Anna JR, Yajima JP, Rosada LJ, et al. Metformin’s performance in in vitro and in vivo genetic toxicology studies. Exp Biol Med (Maywood) 2013. 238 (7): 803–10.
• 53. Prokhorova IV, Pyaskovskaya ON, Kolesnik DL, et al. Influence of metformin, sodium dichloroacetate and their combination on the hematological and biochemical blood parameters of rats with gliomas C6. Exp Oncol 2018; 40 (3): 205–10.
• 54. Cheki M, Shirazi A, Mahmoudzadeh A, et al. The radioprotective effect of metformin against cytotoxicity and genotoxicity induced by ionizing radiation in cultured human blood lymphocytes/ Mutat Res 2016; 809: 24–32.
• 55. Kolivand S, Motevaseli E, Cheki M, et al. The anti-apoptotic mechanism of metformin against apoptosis induced by ionizing radiation in human peripheral blood mononuclear cells. Klin Onkol Fall 2017; 30 (5): 372–9.
• 56. Bikas A, Van Nostrand D, Jensen K, et al. Metformin attenuates 131I-induced decrease in peripheral blood cells in patients with differentiated thyroid cancer. Thyroid 2016; 26 (2): 280–6.
• 57. Product information Histopaque®-1077 Hybri-Max™ (H8889) (https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/2/h8889pis.pdf).
• 58. Bokunyaeva NI, Zolotnitskaya RP. Handbook of clinical laboratory research methods. Moscow: Meditsina, 1975. 338 р. (in Russian).
• 59. Serkiz II., Druzhina NA, Khrienko AP, et al Chemiluminescence of blood under radiation exposure. Kyiv: Naukova Dumka, 1989. 176 p. (in Russian).
• 60. Druzhyna MO, Makovetska LI, Glavin OA, et al. The free-radical processes in peripheral blood of patients with benign breast disease. Oncology 2018; 78 (4): 250–4 (in Ukrainian).
• 61. Lvovskaya EI, Volchegorsky IA, Shemyakov SE, et al. Spectrophotometric determination of lipid peroxidation end products. Medical chemistry issues 1991; 37 (4): 92–3 (in Russian).
• 62. Stal’naya ID, Garishvili TG. Method for determination of malondialdehyde using thiobarbituric acid. In: Modern methods in biochemistry. Orekhovich VN (ed). Moscow: Meditsina, 1997: 66–8 (in Russian).
• 63. Greenberg CS, Craddock PR. Rapid Single-step membrane protein assay. Clinical Chemistry 1982; 28 (7): 1725–6.
• 64. Liochev SI, Fridovich I. Lucigenin (Bis-N-methylacridinium) as a mediator of superoxide anion production. Arch Biochem and Biophys 1997; 337 (1): 115–20.
• 65. Yao K, Wu W, Wang K, et al. Electromagnetic noise inhibits radiofrequency radiation-induced DNA damage and reactive oxygen species increase in human lens epithelial cells. Mol Vis 2008; 19 (14): 964–9.
• 66. Tarpey MM, Wink DA, Grisham MB. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004; 286: R431–44.
• 67. Sivandzade F, Bhalerao A, Cucullo L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio Protoc 2019; 9, Iss. 01. pii: e3128. DOI:10.21769/BioProtoc.3128 (www.bio-protocol.org/e3128)
• 68. MitoPT® JC-1 Assay Manual. ImmunoChemistry Technologies, LLC. #F18–911–8-G, 8 p. (www.immunochemistry.com).
• 69. Riccardi C, Nicoletti I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols 2006; 1 (3): 1458–61.
• 70. Frolov AK, Artsimovich NG, Sokhin AA. Immunocytogenetics. Moscow: Meditsina, 1993. 240 р. (in Russian).
• 71. Domina EA, Pilipchuk EP, Mikhailenko VM, et al. Analysis of mitotic activity of human blood lymphocytes under conditions of combined irradiation and co-mutagens. Belarusian journal Mediko-biologicheskiye problemy zhiznedeyatel’nosti (Gomel) 2015; 14 (2): 48–52 (in Russian).
• 72. Lakin GF. Biometry. Moskow: Vyschaya Shkola, 1990. 352 p. (in Russian).
• 73. Xu G, Wu H, Zhang J, et al. Metformin ameliorates ionizing irradiation-induced long-term hematopoietic stem cell injury in mice. Free Radic Biol Med 2015; 87: 15–25.
• 74. Najafi M, Motevaseli E, Shirazi A, et al. Mechanisms of inflammatory responses to radiation and normal tissues toxicity: Clinical Implications. Int J Radiat Biol 2018; 94 (4): 335–56.

Адреса для листування:
Главін О.А.
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
E-mail: veterok61@ukr.net

Одержано: 22.05.2020