ЕФЕКТИВНІСТЬ НЕОАД’ЮВАНТНОЇ ТЕРАПІЇ ХВОРИХ НА РАК МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЗА ЦИТОЛОГІЧНИМИ, ЦИТОГЕНЕТИЧНИМИ І МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНИМИ КРИТЕРІЯМИ

ВСТУП

Рак молочної залози (РМЗ) займає перше місце серед злоякісних новоутворень жінок як у багатьох країнах світу, так і в Україні [1, 2]. При цьому у переважній більшості РМЗ виявляють на клінічній стадії. Традиційно перед операцією використовували поліхіміотерапію (ПХТ) і променеву терапію (ПТ) [2]. На сьогодні спектр методів неоад’ювантної терапії (НАТ) значно розширився. Так, застосовують комбінації ПХТ і ПТ або ПХТ, ПТ і гормонотерапії (ГТ). Окремо викроистовують внутрішньоартеріальну ПХТ (ВАПХТ) або кріотерапію та ін. [2]. Впровадження різних методів НАТ потребує не тільки оцінки суб’єктивних та об’єктивних клінічних проявів, але й вивчення морфологічних особливостей лікувального патоморфозу на різних рівнях тканинної організації. Результати впливу неоад’ювантної ПХТ чи ПТ на тканину РМЗ досліджувались у поодиноких роботах на гістологічному та цитологічному рівнях [35]. Слід підкреслити, що за допомогою цитологічного методу можна визначити кількісні та якісні зміни окремих пухлинних елементів, їх комплексів, дослідити структурні компоненти кожної клітини. Одним із високоспецифічних морфологічних методів є виявлення ядерцевоутворюючих регіонів хромосом (ЯУР) та визначення ступеня їх активності, що безпосередньо пов’язана із структурою та функціональним станом досліджуваних клітин [611]. Лише в окремих дослідженнях зроблена спроба вивчення деяких морфофункціональних типів ядерець у клі- тинах РМЗ і тільки з діагностичною метою [68]. Останнім часом усе ширше вивчають молекулярнобіологічні особливості клітин РМЗ, що можна використати для визначення чутливості до лікування

на субклітинному рівні [1214].

Мета роботи — визначення впливу різних методів НАТ на клітини РМЗ за допомогою цитоло-

гічних, цитогенетичних і молекулярно-біологічних досліджень.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Цитоморфологічні зміни клітин РМЗ вивчали за розробленою «Схемою цитологічних ознак для формалізованої оцінки кількісного та якісного складу клі- тин РМЗ», що включає 76 ознак та їх градацій і враховує стан клітин, їх розміри, тинкторіальні властивості та характеристику ядра, ядерець і цитоплазми. Проводилицитологічнідослідженнядіагностичнихпункційних матеріалів до використання НАТ і операційних — після лікування. Препарати забарвлювали за методом Паппенгейма. Вивчализміниклітин РМЗпідвпливом ПТ у 10 пацієнток, внутрішньовенної (ВВ) ПХТ — у 33, ВАПХТ — у 10 та поєднаної ВВПХТ і ПТ — у 18. У контрольній групі досліджено пункційний та операційний матеріал 17 хворих, які не отримали НАТ. Вік пацієнток коливався від 29 до 83 років. У кожному випадку вивчали усі фонові та клітинні ознаки РМЗ. Підрахунок проводили у 100 клітинах до і після НАТ та визначали відсотковий вміст кожної ознаки. Індекс ефекту встановлювали за відношенням показників в операційному матеріалі до таких — в пункційному [15]. Матеріал усіх хворих верифікований гістологічно, результатами більшості досліджень встановлено інфільтративний залозистий РМЗ.

При ПХТ використовували схему (циклофосфамід, метотрексат, флуороурацил), рідше — A (циклофосфамід, доксорубіцин, метотрексат, флуороурацил) з інтервалом у 3 тиж від 1 до 6 курсів. ВАПХТ проводили після катетеризації внутрішньої грудної артерії, за схемою . Опромінення хворих здійснювали у класичному режимі фракціювання дози, сумарно від 36 до 40 Гр на пухлину молочної залози та регіонарні зони метастазування тривалістю 1421 день. Цитогенетичні дослідження клітин РМЗ, як і цитоморфологічні, проводили до і після НАТ у цитограмах пункційного і операційного матеріалів відповідно. При цьому вивчали вплив на ЯУР хромосом клітин РМЗ ВВПХТ — у 11 хворих, ВАПХТ — у 4, ПТ — у 3 та поєднаної ВВПХТ і ПТ — у 6. Цитологічні препарати забарвлювали за методом W. . Howell, D.A. Black [16] з урахуванням рекомендацій Z. Likovsky, K. Smetana [17] та за модифікованим методом сріблення, застосованим при вивченні архівних препаратів [18]. Оцінку ЯУР проводили відповідно до класифікації П.В. Челідзе, О.В. Зацепіної на ультраструктурному рівні [19] та робочої схеми Т.М. Туганової та співавторів [7] на світлооптичному рівні при послідовному 900- і 1440- кратному збільшенні імерсійної системи мікроскопа МБИ-15-2. При цьому вивчено загальний та середній вміст основних морфофункціональних типів ядерець й визначені індекси ефекту НАТ [15].

Молекулярно-біологічні дослідження проведені на клітинах операційного матеріалу 31 хворої (контрольна група) та 28 пацієнток після впливу ВВПХТ, 14 — ВАПХТ, 4 — ПТ та 5 — після поєднаної ВВПХТ і ПТ. Вміст ДНК у клітинах РМЗ оцінювали за допомогою проточнофлюороцитометричного методу на приладі AСScan («Becton Dickinson», США) після забарвлення флюорохромом протягом 10 хв (5 мкг/мл пропідію йодиду, 250 мкг/мл рибонуклеази, 0,1% Тритон Х-100 у забуференому фізіологічному розчині). Усі реактиви фірми

«Sima emical o», США. При цьому визначали варіант пухлини за вмістом ДНК (диплоїдний чи анеуплоїдний); індекс ДНК(ІДНК), щохарактеризує відношення інтенсивності флюоресценції піка анеуплоїдних клітин до диплоїдних в анеуплоїдних пухлинах; вміст анеуплоїдних клітин у пухлині; індекс проліферації (ІП), що розраховують, виходячи з кількості клітин у S-фазі клітинного циклу, та апоптичний індекс (АІ).

Отримані результати досліджень статистично обчислювали з використанням критерію Стьюдента. Різниці середніх величин вважали вірогідними при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При цитологічному дослідженні клітин РМЗ до і після окремо проведених ПТ, ВВПХТ, ВАПХТ та поєднаної ВВПХТ і ПТ визначений ряд цитоморфологічних показників, за якими відзначали переважно статистично вірогідні (р≤0,05) зміни у цитограмах операційного матеріалу порівняно з пункційним та встановлювали індекси ефекту проведеної НАТ (табл. 1). Відзначено, що за кількістю високих показників індексів ефекту, при порівнянні з контрольною групою, найбільш виразні цитоморфологічні зміни пухлинних елементів РМЗ відзначали при дії поєднаної ВВПХТ і ПТ і ВАПХТ як окремого виду лікування, дещо менші — при ВВПХТ і найменші — при ПТ. Так, при поєднаному впливі ВВПХТ і ПТ відзначали максимальне збільшення кількості полі- морфних клітин та пухлинних елементів РМЗ з нормохромними ядрами, рівномірною дрібнозернистою або дрібнобрильчатою структурою хроматину та дрібними ядерцями. Дія неоад’ювантної ВАПХТ характеризувалась максимальним збільшенням кількості клітин РМЗ з великовакуолізованою цитоплазмою та великими ядерцями та найменшою кількістю пухлинних елементів з ядрами, що мали компактну структуру хроматину. Використання ВВПХТ зумовило найбільше зростання кількості клі- тин РМЗ великих розмірів і з гіпохромними ядрами, а ПТ — збільшення кількості ядер з середніми та великими ядерцями. Отримані показники відображають інтенсивність зазначених змін клітин РМЗ під впливом проведеної терапії і можуть бути використані як цитологічні критерії лікувального патоморфозу НАТ.

Для виявлення деструктивних ознак клітин РМЗ залежно від методу НАТ на субклітинному рівні проведені цитогенетичні дослідження з визначенням морфофункціональних типів ядерець. Встановлено, що загальна кількість ядерець у клітинах РМЗ після різних видів НАТ збільшувалась переважно за рахунок їх неактивних форм (табл. 2). Кількість активних ядерець — компактних і нуклеолонемних — мало значні коливання залежно від методу НАТ. Так, компактні ядерця рідше всього виявляли в ядрах клітин РМЗ після ВАПХТ, а потім їх кількість послідовно збільшувалась при окремому проведені ПТ, ВВПХТ і поєднаному — ВВПХТ з ПТ. Подібну тенденцію відзначали і щодо нуклеолонемних ядерець. Неактивні кільцеподібні ядерця у найбільшій кількості визначені у клітинах РМЗ після ВАПХТ (3,38 ± 0,04), у вірогідно меншій — після ВВПХТ (2,73 ± 0,03) і виявляли її послідовне зменшення після ПТ (2,09 ± 0,04) і поєднаної ВВПХТ і ПТ (1,87 ± 0,05).

Таблиця 1

Індекси ефекту різних методів НАТ хворих на РМЗ за цитологічними ознаками

Слід зазначити, що число мікроядерець характеризує ступінь некротичних змін у ядрі та яскраво відображає уражуючу дію різних методів лікування. При цьому встановлено, що ядра пухлинних клітин під дією поєднаної ВВПХТ і ПТ, а також ВАПХТ, мають найбільшу кількість мікроядерець (13,59 ± 0,35 і 10,20 ± 0,10 відповідно), меншу — при окремому використанні ВВПХТ чи ПТ (9,92 ± 0,14 і 8,98 ± 0,17 відповідно). Індекси ефекту проведеної НАТ високі при поєднаному використанні ВВПХТ і ПТ, а також окремо — ВАПХТ, нижчі — при ВВПХТ і ПТ. Виявлені вірогідні зміни морфофункціонального складу ядерець відповідають інтенсивності впливу різних видів НАТ на проліферативний потенціал клі- тин РМЗ і на ступінь їх дистрофічних змін.

Результати ДНК-цитофлюорометричних досліджень свідчать, що при неоад’ювантній дії ПТ як окремого виду лікування, так і у поєднанні з ВВПХТ, відзначали тільки диплоїдний варіант пухлин (табл. 3). У пухлинах пацієнток цих двох груп найбільш виражений лікувальний патоморфоз клі- тин РМЗ після проведення НАТ, що визначено за високими показниками АІ. Крім того, у групі хворих, яким проводили ВВПХТ і ПТ, виявлений найнижчий ІП. Під впливом на РМЗ як ВВПХТ, так і ВАПХТ, у пухлинах з диплоїдним і анеуплоїдним варіантами ДНК відзначено певне зростання пролі- феративного потенціалу клітин. При цьому відзначали деяке підвищення ІДНК в анеуплоїдних варіантах пухлин. Після використання неоад’ювантної ВВПХТ відзначали підвищення АІ у пухлинах з диплоїдним вмістом ДНК, а після ВАПХТ — з диплоїдним і анеуплоїдним варіантом ДНК, що свідчить про більш високу чутливість клітин РМЗ до передопераційної ВАПХТ, ніж до ВВПХТ. Разом з тим, використання неоад’ювантної ВАПХТ сприяло зменшенню кількості випадків з анеуплоїдним варіантом пухлин до 36 проти 48% у контрольній групі. Слід зазначити, що зниження ступеня анеуплоїдності у пухлині є ознакою більш сприятливого прогнозу захворювання, оскільки саме наявність анеуплоїдних клітин визначає прогресуючий характер перебігу пухлинного процесу.

Таким чином, отримані оригінальні морфологічні дані, що вказують на ступінь пошкоджувальної дії НАТ на клітини РМЗ і дозволяють визначити найбільш ефективний спосіб передопераційної терапії.

ВИСНОВКИ

1. Найбільш інформативні цитологічні ознаки, за якими можна визначити рівень девіталізуючих впливів НАТнаклітини РМЗ, це— великі, поліморфні елементи з великими вакуолями у цитоплазмі; нормоі гіпохроматоз ядер; компактна, рівномірна дрібнобрильчата чи рівномірна дрібнозерниста структура хроматину, а також наявність і кількість ядерець різних розмірів.
2. За цитоморфологічними і цитогенетичними ознаками виявлено найбільший девіталізуючий ефект від НАТ у хворих, яким проводили ВАПХТ і поєднану ВВПХТ і ПТ.
3. Виявлена загальна закономірність відносно морфофункціональних типів ядерець — кількість високоактивних їх форм зменшується під дією різних видів НАТ, а малоактивних збільшується, що свідчить про зростання дистрофічних змін у клітинах РМЗ і віддзеркалює ефект лікувальної дії.
4. За молекулярно-біологічними показниками найбільш ефективний вплив на клітини РМЗ та більш сприятливий прогноз визначено після неоад’ювантної поєднаної дії ВВПХТ і ПТ.

   Таблиця 2

   Морфофункціональні типи ядерець та індекси ефекту при різних видах НАТ хворих на РМЗ

   Морфофункціональний тип ядерець	Пункційний матеріал n = 24	Операційний матеріал після різних видів НАТ
   		ВВПХТ n = 11	ВАПХТ n = 4	ПТ n = 3	ВВПХТ і ПТ n = 6
   Компактні ядерця	0,07 ± 0,01*	0,05 ± 0,01*	0,02 ± 0,011	0,03 ± 0,011	0,06 ± 0,01
   		0,71**	0,29	0,42	0,85
   Нуклеолонемні ядерця	1,59 ± 0,02	1,87 ± 0,031	1,40 ± 0,021	1,79 ± 0,031	1,28 ± 0,031
   		1,18	0,89	1,13	0,80
   Кільцеподібні ядерця	1,82 ± 0,02	2,73 ± 0,031	3,38 ± 0,041	2,09 ± 0,041	1,87 ± 0,05
   		1,50	1,86	1,15	1,03
   Мікроядерця	7,55 ± 0,13	9,92 ± 0,141	10,20 ± 0,101	8,98 ± 0,171	13,59 ± 0,351
   		1,31	1,35	1,19	1,80
   Середнє число ядерець у ядрі	11,03 ± 0,19	14,57 ± 0,201	15,00 ± 0,201	12,89 ± 0,311	16,81 ± 0,191
   		1,32	1,36	1,17	1,52

   *Середня кількість ядерець у ядрі, абсолютні значення; **показники індексів ефекту при зіставленні основних морфофункціональних типів ядерець у пункційному й операційному матеріалі; 1р<0,05 порівняно з пункційним матеріалом.

   Результати проточної цитофлюориметрії клітин РМЗ при різних методах НАТ

   Таблиця 3

   Метод неоад’ю­ вантної терапії	Варіант пухлини за вмістом ДНК	Число хво­ рих (%)	Кількість клітин у пухлині (%)		ІП	ІДНК	АІ
   			диплоїдні	анеуплоїдні
   Без неоад’ювантної терапії, n = 31	Диплоїдний	52	100,00	—	23,48 ± 4,31	—	25,93 ± 2,99
   	Анеуплоїдний	48	54,08 ± 5,91	45,92 ± 5,91	23,96 ± 2,99	1,56 ± 0,12	22,32 ± 2,73
   ВВПХТ, n = 28	Диплоїдний	46	100,00	—	28,01 ± 5,36	—	28,92 ± 4,76
   	Анеуплоїдний	54	57,78 ± 5,09	42,22 ± 5,09	31,32 ± 4,14	1,82 ± 0,15	22,14 ± 3,05
   ВАПХТ, n = 14	Диплоїдний	64	100	—	28,81 ± 5,46	—	30,69 ± 5,47
   	Анеуплоїдний	36	50,97 ± 13,25	49,03 ± 13,25	28,55 ± 6,75	1,73 ± 0,12	28,31 ± 6,55
   ПТ, n = 4	Диплоїдний	100	100,00	—	29,41 ± 11,49	—	45,25 ± 10,73
   	Анеуплоїдний	—	—	—	—	—	—
   ВВПХТ і ПТ, n = 5	Диплоїдний	100	100	—	18,89 ± 5,44	—	39,66 ± 16,46
   	Анеуплоїдний	—	—	—	—	—	—

    

   • ЛІТЕРАТУРА

     1. Федоренко ЗП, Гулак ЛО, Горох ЕЛ та ін. Рак в Україні 20032004. Київ, 2005; (6). 97 с.

     2. Шалимов СА, Тарутинов ВИ, Литвиненко АА. Рак молочной железы. Укр хіміотерапевт журн 1999; (4) 6370.

     3. Галахин КА, Югринов ОГ, Курик ЕГ и др. Химиотерапевтический патоморфоз злокачественных опухолей. Укр хіміотерапевт журн 2000; (4) 812.

     4. Заридзе МВ, Герсамия РК, Буркадзе РМ. Возможные критерии оценки постхимиотерапевтического патоморфоза при инфильтративном раке молочной железы. eo e News 2002; (3) 347.

     5. Страхова ТН, Читириди НГ, Богатырев ВН. Количественная оценка цитоморфологических изменений у больных раком молочной железы до и после лучевой терапии. В Тр республиканского съезда врачей-лаборантов БССР. Минск, 1986 1934.

     6. Лебекова ЖТ, Шибанова АИ. Определение активности ядрышко-организующих зон в дифференциальной диагностике заболеваний молочной железы. Новости клин цитол России 2000; 4 (34) 902.

     7. Туганова ТН, Болгова ЛС, Махортова МГ, Алексеенко ОИ. Морфофункциональные типы ядрышек в цитологической диагностике фиброаденом и рака молочной железы. Новости клин цитол России 2004; 8 (12) 2730.

     8. Туганова ТН, Болгова ЛС, Алексеенко ОИ, Махортова МГ. Качественные и структурные особенности проявления ядрышкообразующих регионов хромосом в клетках рака молочной железы. Цитол и генет 2005; 39 (4) 5763.

     9. Упоров АВ, Цирлина ЕВ, Пожарисский КМ. Сравнительное изучение пролиферации (по виявлению антигена Кi-67) и активности ядрышковых организаторов клеток рака молочной железы. Вопр онкологии 1998; 44 (3) 31624.

     10. Guski H, Hufnagl P, Kaufmann O, et al. ANOR analis of atypical uctal ypeplasia an intauctal cacinoma of te beast. Anal Quant ytol Histol 2000; 22 (3) 20612.

     11. Ceccareli C, Trere D, Santini D, et al. ANORs in beast tumos. icon 2000; 31 (2) 143.

     12. Абраменко ИВ, Фильченков АА. Прогностическое значение апоптического и пролиферативного индексов при солидных новообразованиях. Онкология 2002; 4 (3) 16570.

     13. Степанова ЕВ, Загрекова ЕИ, Ермилова ВД и др. Молекулярно-биологические маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы А стадии. Архив патол 2003; 65 (3) 148.

     14. Bagwell CB, Clark GM, Spyratos F, et al. Optimizin flow cytometic DNA ploiy an S-pase faction as inepenent po-

         nostic makes fo noe-neative beast cance specimens. y- tomety 2001; 46 (3) 12135.

     15. Лушников ЕФ. Лучевой патоморфоз опухолей человека. Москва Медицина, 1977 97.

     16. Howell M, Black D. ontolle silve stainin of nucleo- la eions wit potective colloial evelope a one step meto. Expeientia 1980; 36 10145.

     17. Likovsky Z, Smetana K. ute stuies on te cytoce- misty of te stanaize silve stainin of intepase nucleoli in smea pepaation of Yosia ascitic sacoma cells in ats. Histo- cemisty 1981; 72 (2) 30113.

     18. Болгова ЛС, Туганова ТН, Кузина ИС. Модификация окраски по Howell W., Black D. на выявление ядышкообразующих регионов хромосом при лимфопролиферативных заболеваниях. N Д-26735. Рукопись депонирована в ГЦНМБ (Россия) 20.04.01.

     19. Челидзе ПВ, Зацепина ОВ. Морфофункциональная классификация ядрышек. Успехи современ биол 1988; 105 (2) 25268.