ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ЩІЛЬНОСТІ МІКРОСУДИН У СЕРОЗНИХ АДЕНОКАРЦИНОМАХ ЯЄЧНИКА

ВСТУП

Загальновідомо, що ангіогенез, який відбувається завдяки здатності ендотеліальних клітин до самовідтворення та міграції, є одним з процесів, що визначають потенцію пухлини до прогресії та метастазування [1]. Проте судиноутворення у пухлинах має патологічні ознаки: судини набувають підвищеного розгалуження і проникності. Так, було показано, що для злоякісних серозних пухлин яєчника характерним є рясне, хаотичне розташування кровоносних судин, відзначають капіляроподібні судини та судини, що нагадують посткапілярні венули. Стінка таких судин потоншена, базальна мембрана переривчаста, більша частина мікросудин синусоїдного типу з різко вираженим повнокров’ям [2].

Активаторами ангіогенезу є різноманітні цитокі- ни, у тому числі ростові фактори-мітогени, які продукуються або індукуються пухлинними клітинами. Фактор росту ендотеліальних клітин (VEGF) є глікопротеїном, який посідає особливе місце у ангіогенезі. Він стимулює проліферацію ендотеліальних клі- тин, значно посилює проникність утворених судин, що сприяє дисемінації пухлинних клітин. Зокрема, з проникністю судин пов’язують локальну екстравазацію, яка спостерігається при деяких пухлинах, у тому числі при раку яєчника (РЯ) [3].

До негативних регуляторів ангіогенезу належать такі фактори, як ангіостатин, гепариназа, інтерферони (α і β), тромбоспондини (1 і 2), інгібітор металопротеїназ та ін. [4]. Слід зазначити, що процеси судиноутворення контролюються рядом білків, які є продуктами деяких протоонкогенів і генівсупресорів. Серед останніх значну роль відіграє ген ТР53. Білок р53 «дикого» типу інгібує експресію VEGF і одночасно активує інгібітори ангіогенезу — тромбоспондини. Неактивовані форми білка р53, які виникають у результаті мутаційних змін гена ТР53 або інгібуючого впливу білків-модуляторів його активності, втрачають здатність контролювати ангіоге-

нез. Додатковими чинниками, що впливають на цей процес, є активація онкогенів родини МУС (інгібі- тори тромбоспондинів) та родини RAS (активатори транскрипційного комплексу АР-1, ряду металопротеїназ і транскрипційного фактору Ets1) [5]. Суттєве значення в регуляції активності білка VEGF відіграє ген BRCA1, білок якого є інгібітором експресії гена VEGF. Причому посередниками між білком BRCA1 і геном VEGF виступають рецептори естрогену альфа (РЕ-ά), з якими з’єднується BRCA1. Тобто регуляція транскрипції і експресії VEGF залежить як від активності білка BRCA1, так і білка РЕ-ά [ 6].

Згідно з даними літератури у процесах метастазування та виникнення рецидивів РЯ ангіогенез відіграє суттєву роль. Проте не існує однозначної думки щодо прогностичного значення неоваскуляризації при цій патології. Так, у дослідженнях Hаllingsworth et al. [7] було визначено, що щільність мікросудин (ЩМС) при серозних аденокарциномах яєчника є вагомим прогностичним показником як загальної виживаності, так і безрецидивного перебі- гу хвороби. Іншими авторами не було виявлено зазначених закономірностей при цій патології [8].

Сьогодні одним із підходів до аналізу активності ангіогенезу в тканинах є визначення рівня експресії генів родини VEGF або їх рецепторів та оцінка ЩМС.

Враховуючи сказане вище, мета дослідження полягала у зіставленні ЩМС, експресії молекулярнобіологічних маркерів проліферації Кі-67, р53 і рецепторів естрогенів (РЕ) у злоякісних новоутвореннях з клініко-морфологічними характеристиками перебігу пухлинного процесу у хворих на РЯ.

ОБ̓ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Робота виконана на операційному матеріалі 81 хворої на РЯ віком від 39 до 79 років (середній вік — 46,6 ± 2,4 року), які не отримували передопераційної терапії. Усі пацієнтки знаходилися на лі-

куванні у відділенні онкогінекології Інституту онкології АМН України (зав. відділенням — д.м.н., проф. Л.І. Воробйова) у період із 1988 по 2007 р. У 16 хворих на РЯ були виявлені віддалені метастази, у 47 хворих — поодинокі метастази у регіонарних лімфовузлах, а у 18 хворих метастазів не виявлено. Термін життя 18 хворих на РЯ не перевищував 5 років, 22 хворі були живі протягом 5 років і більше (до 17 років).

Заключний морфологічний діагноз встановлювали на гістологічних препаратах, забарвлених гематоксилі- ном та еозином. Імуногістохімічне виявлення експресії біомаркерів в пухлинах яєчника здійснювали на депарафінованих зрізах, згідно зр екомендаціями Елінідіта співавторів [9], з використанням первинних моноклональних антитіл(МкАТ): Ki-67, клон MIB-1; р53, клон DO-7, РЕ, клон 1D5; CD34, клон QBEnd10 та системи візуалізації EnVision. Забарвлення білка здійснювали за допомогою хромогена — 3-діамінобензидину тетрахлориду (ДАБ). У роботі використані МкАТ, система візуалізації і ДАБ («DakoCytomation», Данія). Ядра клітин дофарбовували гематоксиліном Майєра.

Результати імуногістохімічної реакції оцінювали

напівкількісним методом, шляхом підрахунку кількості позитивно забарвлених клітин — індекс мітки (ІМ) для білків р53 і РЕ та індекс проліферації (ІП) для білка Кі-67. Експресію маркерів визначали у 600–1000 пухлинних клітинах. Для з’ясування щільності судин у пухлинах яєчника підраховували кількість судин у 10 полях зору мікроскопу (розмір одного поля зору обмежувався вимірювальною квадратною сіткою із стороною 0,79 мм) з наступним визначенням їх числа на 1 мм2 за формулою: ЩМС = n · 1 мм2 : 0,625 мм2, де n — середня кількість судин на одне поле зору; 0,625 мм2 — площа одного поля зору. При виконанні роботи враховували наступні клініко-морфологічні характеристики: стадія захворювання за класифікацією FIGO (І–ІV), термін виживаності хворих після операції, особливості терапії (схеми і кількість курсів поліхіміотерапіі — ПХТ) та патогістологічний діагноз. Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали за допомогою пакету програм Microsoft Excel. Для перевірки гіпотези рівності середніх значень двох вибірок використовували непараметричний критерій Вілкоксона — Манна — Уітні (критерій U). Достовірними вважали відмінності при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При морфологічному аналізі новоутворень яєчника встановлено, що усі пухлини були серозними аденокарциномами різного ступеня диференціювання: 10 — високо-, 34 — помірнота 37 — низькодиференційовані (відповідно ВДА, ПДА та НДА).

Результати імуногістохімічного дослідження показали, що експресію трансмембранного білка міжклітинної адгезії — CD-34 відзначали в усіх пухлинах яєчника. Виявлено значну гетерогенність васкуляризації цих новоутворень як у пухлинах різних

хворих, яка залежала від ступеня диференціювання пухлин і була найбільше виражена у НДА яєчника, так і у межах однієї пухлини. Значення ЩМС коливалися від 10 до 128 судин на 1 мм2, що в середньому склало 63,6 ± 2,9. Позитивну експресію білків Кі-67, р53 та РЕ відзначено у більшості аденокарцином яєчника (відповідно у 71,5; 88,2 та 73,8%). Середня кількість клітин з експресією білків Кі-67, р53 та РЕ складала відповідно 20,4 ± 0,2%; 28,5 ± 0,2%

та 29,3 ± 0,2%.

При аналізі прогностичного значення ЩМС у пухлинах хворих на РЯ з’ясувалося, що у групі хворих, термін життя яких складав < 5 років, щільність судин у пухлинах була достовірно (р < 0,05) вищою (на 15 судин на 1 мм2), порівняно з такою у хворих, що були живі після операції 5 років і більше (табл. 1). При цьому в останніх достовірно вищою (на 7,1%) була експресія РЕ і нижчою (на 6,6%) експресія білка р53.

Таблиця 1 Експресія білків р53, РЕ і ЩМС у пухлинах хворих на серозний

РЯ в залежності від термінів життя

На думку деяких дослідників, активація ангіогенезу у новоутвореннях яєчника супроводжується підвищеною здатністю пухлини до інвазії [10]. Тому низьку ЩМС у епітеліальних злоякісних пухлинах яєчника автори пов’язують з кращою 5-річною виживаністю хворих з І та ІІ і навіть ІІІ та IV стадіями і вважають, що ступінь неоваскуляризації пухлин може мати прогностичне значення для хворих на РЯ [11, 12].

Крім цього, нами було проаналізовано ЩМС і експресію білків р53 та РЕ у серозних пухлинах яєчника в залежності від наявності у хворих на рак метастазів. Проведений аналіз показав відсутність достовірної різниці ЩМС у хворих без метастазів, порівняно з відповідними показниками у пацієнток з віддаленими метастазами, з вираженою тенденцією до збільшення цього показника у хворих з метастазами. Натомість, рівень експресії білків р53 та РЕ в пухлинах хворих з метастазами був достовірно нижчий (р < 0,05) за рівень експресії цих білків у пухлинах хворих без метастазів. При цьому звертають на себе увагу значні відмінності у рівні експресії саме РЕ в залежності від наявності у хворих віддалених метастазів (табл. 2).

Таблиця 2 ЩМС та експресія білків р53 та РЕ у пухлинах хворих на РЯ без

метастазів та з віддаленими метастазами

Як видно з представлених даних, наявність віддалених метастазів у хворих на серозний РЯ асоцію-

ється з підвищенням ЩМС та зниженням експресії РЕ. Про наявність такої залежності говорять і інші автори [6], які вважають, що активація ангіогенезу у пухлинах молочної залози виникає завдяки підвищенню експресії гена VEGF, який у свою чергу знаходиться під контролем білка BRCA1, і відбувається за участю РЕ-ά. Оскільки мутації гена BRCA1 є частою подією при РЯ, логічно припустити, що активація ангіогенезу у досліджених пухлинах яєчника може бути наслідком інактивації білка BRCA1 і зниженням рівня експресії РЕ.

Оскільки, згідно з даними літератури, виживаність хворих на рак різного генезу у більшості випадків обумовлена ступенем диференціювання пухлин, нами був зроблений порівняльний аналіз рівня ЩМС у серозних аденокарциномах яєчника різного ступеня диференціювання. Проведене зіставлення показало, що при ВДА та ПДА яєчника щільність судин була майже однаковою, а при НДА спостері- галася виражена тенденція до підвищення ЩМС, яка, однак, завдяки значній варіабельності цього показника була недостовірною (табл. 3).

30,0%, а для показника ЩМС медіанне значення кількості судин на 1 мм2 становило 60. Враховуючи значення медіан, нами були використані наступні критерії оцінки ступеня експресії досліджених біомаркерів: для білків р53 та РЕ ІМ < 30,0% вважали низькою експресією, а ІМ ≥ 30,0% — високою. ЩМС < 60 судин на 1 мм2 вважали низькою, а ЩМС ≥ 60 — високою. Оцінку проліферативного потенціалу проводили за іншими критеріями відповідно до рекомендацій літератури і згідно з результатами наших попередніх досліджень [13]. При значеннях ІП < 10,0% експресію білка Кі-67 вважали низькою, а при ІП ≥ 10,0% — високою.

Згідно з розробленими критеріями кількість пух-

лин з високою і низькою ЩМС змінювалася в залежності від ступеня їх диференціювання. Так, у групі хворих на ВДА яєчника тільки 37,5% пухлин мали високу ЩМС, а у хворих з НДА яєчника кількість випадків з високою ЩМС збільшувалася до 55,9% (рисунок).

Таблиця 3

ЩМС і експресії білків Кі-67, р53 та РЕ у серозних новоутвореннях яєчника різного ступеня диференціювання

Проліферативний потенціал епітеліальних пухлин яєчника, оцінений за кількістю клітин експресуючих Кі-67, достовірно (р < 0,001) збільшувався при ПДА та НДА яєчника, відповідно на 5,3 та 6,4%, порівняно з таким при ВДА. Одночасно з останнім спостерігалось достовірне (р < 0,05) збільшення експресії білка р53 у НДА яєчника, порівняно з таким у ВДА та ПДА відповідно на 8,2 та 5,8%. На відміну від цього, спрямованість змін експресії РЕ була протилежною, а саме достовірно (р < 0,05) зменшувалася, при зниженні ступеня диференціювання пухлин на 19,8 та 30,0% (відповідно для ПДА та НДА порівняно з показниками у ВДА). Як видно з представлених середніх даних, високу ЩМС у серозних пухлинах яєчника виявляли при високих значеннях експресії білка р53 та низьких РЕ і вона не корелювала з проліферативним потенціалом пухлин.

При аналізі клінічних особливостей у хворих на РЯ було визначено, що у пацієнток з віддаленими метастазами переважали НДА яєчника (у 81,2% пухлин), а у жінок без метастазів — ВДА та ПДА (у 60,1% пухлин). У групі хворих, які померли у перші 5 років після операції, високодифереційованих пухлин не виявляли.

Для більш детальної оцінки взаємозвязку між експресією досліджених біомолекулярних маркерів нами було використано статистичний метод оцінки медіан (Ме). Так, було визначено, що для білків р53 та РЕ медіанне значення ІМ дорівнювало

Рисунок. Кількість пухлин з високою і низькою ЩМС у хворих на серозний РЯ різного ступеня диференціювання

У той же час у хворих з патогістологічним діагнозом ВДА яєчника переважна кількість пухлин мала низький індекс проліферації та високий рівень експресії РЕ. При цьому кількість пухлин з низькою і високою експресією білка р53 була майже однаковою. У хворих з НДА яєчника переважали високопроліферуючі пухлини з високою експресією білка р53 і низькою або відсутньою експресією РЕ (табл. 4).

Таблиця 4 Кількість пухлин з високою і низькою експресією білків Кі-67, р53 та РЕ у хворих на серозний РЯ різного ступеня диференціювання

Судячи з отриманих даних, можна говорити, що у більшості вивчених пухлин яєчника білок р53 не впливав на процеси проліферації і ангіогенезу, що може бути пов’язано з підвищенням зміненої форми білка р53 у пухлинах яєчника, яка знижує його інгібуючий вплив на вищезгадані процеси. Більше того, згідно з результатами інших дослідників [14],

стимуляція неоваскуляризації у пухлинах яєчника може підвищуватись в умовах гіпоксії, незалежно від стану гена ТР53, а за рахунок активації фактора HIF-1ά. На відміну від цього, наявність оберненої залежності між ЩМС та експресією РЕ у НДА яєчника, напевно, свідчить про залежність судиноутворення в цих пухлинах від експресії РЕ.

Виходячи з результатів дослідження, можна говорити про існування зв’язку між ступенем неоваскуляризації серозних аденокарцином яєчника та ступенем їх диференціювання, оскільки кількість пухлин з високим рівнем ЩМС у групі хворих з НДА була майже у 1,5 раза вище ніж у хворих з ВДА та ПДА яєчника, і у НДА виявлено тенденцію до підвищення кількості судин на 1 мм2. Ці дані дещо суперечать результатам інших дослідників, які показали, що високота помірнодиференційовані сосочкові цистаденокарциноми яєчника більш васкуляризовані, ніж низькодиференційовані пухлини [2].

Таким чином, проведене дослідження показало,

що у серозних аденокарциномах яєчника спостері- гається значна гетерогенність ЩМС, яка найбільш виражена в низькодиференційованих пухлинах. Визначено, що поява віддалених метастазів у аденокарциномах яєчника асоціюється з низьким рівнем експресії РЕ і незначним підвищенням ЩМС. Встановлено, що у хворих, термін життя яких складав < 5 років, ЩМС у пухлинах та експресія білка р53 були достовірно вищими, а експресія РЕ — достовірно нижчою, порівняно з такими у пухлинах хворих, що були живі після операції 5 років і більше. Отримані дані свідчать, що для оцінки перебі- гу серозного раку яєчника перспективним є визначення ЩМС, експресії р53 та РЕ в якості прогностичних маркерів пухлинного процесу.

ЛІТЕРАТУРА

1. Амчиславский ЕИ, Соколов ДИ, Сельков СА, Фрейдлин ИС. Пролиферативная активность эндотелиальных клеток человека линии ЕА.hy926 и ее модуляция. Цитология 2005; 47 (5): 393–402.

2. Михалева ЛМ, Мороз ЕА, Бархина ТГ и др. Морфо-

groqth factor (VEGF) transcription and secretion in breast cancer cells. Oncogene 2002; 21: 7730–9.

1. Hallingswarth HC, Kohan EC, Sterinberg SM, et al. Tumor angiogenesis in advanced stage ovarian carcinoma. Am J Pathol 1995; 147: 33–41.

2. Nakayama K, Kanzaki A, Takebayashi Y, et al. Different features of angiogenesis between ovarian and breast carcinoma. Cancer Lett 2001; 170: 161–7.

3. Эллиниди ВН, Аникеева НВ, Максимова НА. Практическая иммуноцитохимия (методические рекомендации). Санкт-Петербург: ВЦЭРМ МЧС Розсип, 2002. 36 с.

4. Abulafia O, Ruizi JE, Holcomb K, et al. Angiogenesis in earli-invasive low-malignant-potential epithelial ovarian carcinoma. Obstet Gynecol 2000; 95: 548–52.

5. Alvarez AA, Krigman HR, Whicker RS, et al. The prognostic significance of angiogenesis in epithelial ovarian cancer. Clin Cancer Res 1999; 5: 587–91.

6. Bamberger ES, Perrett CW. Angiogenesis in epithelian ovarian cancer. J Clin Pathol 2002; 55: 348–59.

7. Buchynska LG, Nesina IP, Yurchenko NP, et al. Expression of p53, p21waf1/cip1, p16ink4a and Кi-67 proteins in serous ovarian tumours. Exp Oncol 2007; 29 (1): 49–53.

8. Horiuchi A, Imai T, Shimizu M, et al. Hypoxia-induced changes in the expression of VEGF, HIF-1 alpha and cell cycle- related molecules in ovarian cancer cells. Anicancer Res 2002; 22 (5): 2697–702.

   функциональная характеристика кровеносных сосудов ми

   кроциркуляторного русла в серозных опухолях яичников. Арх патол 2005; (6): 28–31.

   1. Ровенський ЮА. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии. Биохим 1998; 63 (9): 1204–21.

   2. Черноглазова ЕВ, Дбар ЖН, Степанова ЕВ. Молекулярные механизмы опухолевого неоангиогенеза. Успехи соврем биол 2004; 124 (5): 480–8.

   3. Копнин БП. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. В кн: Канцерогенез. Под ред ДГ Заридзе. Москва: Медицина, 2004. 575 с.

   4. Kawai H, Li H, Chun Ph, et al. Direct ineraction between BRCA1 and the estrogen receptor regulates vasculiar endotelial