ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕМОПОЭЗА У БОЛЬНЫХ С МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

ВВЕДЕНИЕ

Клеточный гомеостаз в организме поддерживается путем баланса между процессами клеточной пролиферации и гибели. Нарушение данного равновесия за счет либо неконтролируемой пролиферативной активности определенных популяций клеток, либо усиленного или недостаточно активируемого апоптоза играет ключевую роль в патогенезе многих, в том числе онкогематологических, заболеваний [1, 2, 3].

В последнее время особый интерес вызывает изучение различных патогенетических аспектов миелодиспластического синдрома (МДС), как одного из наиболее сложных гематологических заболеваний, имеющего клональную природу и характеризующегося неэффективным гемопоэзом.

Несмотря на еще недавнее трактование данной патологии как «предлейкозного состояния», МДС имеет свои, отличающиеся от острой лейкемии (ОЛ), особенности. Одна из них — существование маркерного для МДС феномена, так называемого антонима: наибольшее количество апоптотических клеток (до 90%) выявляют в пролиферирующей популяции, то есть в S­ и 2­фазах клеточного цикла (К). роцентное соотношение количества S­фазных и апоптотических клеток используется для оценки течения опухолевого процесса.

Как известно [4], МДС характеризуется высоким уровнем пролиферации клеток миелоидного ряда с более короткой (почти в два раза) продолжительностью К по сравнению с таковой у субстратных клеток больных острой миелоидной лейкемией (ОМЛ) de novo. ри этом продолжительность К бластных клеток костного мозга (КМ) больных ОМЛ­post МДС еще выше, чем при первичной ОЛ. В связи с этим высказано предположение [4] о том, что более диф­

ференцированные клетки пролиферируют активнее. Медленная пролиферация бластных клеток при вторичной лейкемии, по сравнению с первичной ОЛ, объясняется вовлечением в трансформацию более примитивных клеток с низким пролиферативным потенциалом. Возможно, данное различие, обусловленное глубиной и степенью поражения клеточного субстрата КМ, объясняет и разную чувствительность первичной и вторичной лейкемии к химиотерапии: ОМЛ­post МДС характеризуется более высокой резистентностью.

Немаловажное значение для прогноза заболевания имеет также уровень плоидности, выражаемый индексом ДНК (ДИ), и отражающий содержание ДНК в клетках, находящихся в фазе 01 К []. У больных с МДС количество анеуплоидных клеток варьирует в широких пределах [6]. олучены данные [7], согласно которым при МДС отмечали анеуплоидию в 67% бластных клетокпромиелоцитов, среди которых 9% — гиподиплоидные, причем повышение показателя ДИ часто предшествует развитию рецидива у больных с МДС, что является отражением кариотипических аномалий [7, 8].

В последнее время в клинической онкогематологии широко используются данные параметров К, полученные методом проточной ДНК­цитометрии, для определения прогноза заболевания и контроля эффективности проводимой терапии. Кроме того, данный метод позволяет контролировать динамику роста опухолевого клона и выявлять минимальную остаточную болезнь у пациентов с анеуплоидной фракцией в ремиссии заболевания. Большинство исследований цитокинетических параметров касается опухолевого клона при различных лейкемиях, относительно МДС данные являются малочисленными и неоднозначными.

ель данного исследования — оценка особенностей К гемопоэтических клеток КМ больных с МДС для выявления дополнительных прогностических критериев заболевания.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал для исследований брали у больных, находящихся на стационарном лечении в отделении заболеваний системы крови Института гематологии и трансфузиологии АМН Украины, а также в гематологическом отделении Главного военного госпиталя МО Украины. Исследуемую группу составляли пациенты с впервые установленным диагнозом. В контрольную группу вошли практически здоровые лица (10 человек) без гематологических заболеваний в анамнезе.

Работа базируется на результатах исследования

К пунктата КМ 22 больных с МДС (17 мужчин, медиана возраста — 9 лет и женщин, медиана возраста — 68 лет). Верификацию диагноза проводили на основании общеклинических, морфологических, цитохимических и гистологических исследований. Согласно ФАБ­классификации все диагностированные МДС разделили на такие нозологические формы: рефрактерная анемия (РА) — 6, рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ) — 4, хроническая миеломоноцитарная лейкемия (ХММЛ) — 12 ( — МДС­ХММЛ с миелодиспластическими и 7 — ХММЛ с миелопролиферативными признаками заболевания МЗ­ХММЛ). Разделение ХММЛ на два подтипа осуществляли на основании количества лейкоцитов в периферической крови (более или менее 13 х 109л) в соответствии с предложенным в 1996 г. дополнением к ФАБ­классификации. Для анализа клеточного состава костномозгового пунктата мазки окрашивали по методу Романовского — Гимзы.

араметры К (количество клеток в 01­, S­

и 2­фазах) и плоидность ДНК гемопоэтических клеток в образцах КМ изучали методом проточной цитофлюориметрии (S, «to ­

so», СА) с применением интеркалирующего красителя йодистого пропидия (модифицированный метод Noltt [9]). Результаты исследования представлены в виде ДНК­гистограмм, проанализированных посредством специализированной математической программы ot 2.01 (S, СА) с учетом рекомендаций N tot o­ ssus o (1993).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Sttsot Sttst

6.0. Для каждого исследуемого показателя определяли: среднее значение, стандартное отклонение от среднего значения в пределах одной группы. Достоверность отличий данного показателя от нормы и от других аналогичных показателей при сравнении групп между собой определяли по непараметрическому ­критерию Манна — Уитни. Для определения наличия корреляции между отдельными показателями использовали непараметрический критерий Спирмана. Анализ выживаемости проводили по методу Каплана — Майера. Оценку зависимости функции выживания от исследуемых параметров осуществляли методом регрессионного анализа по Коксу.

РЕЗуЛЬТАТЫ И ИХ ОБСуЖДЕНИЕ

Средние значения величины основных параметров К КМ представлены в табл. 1. Как видно из данных таблицы, МДС — заболевание с довольно высоким пролиферативным потенциалом гемопоэтических клеток КМ (фазы К S 2), наибольшим при РА. ри малигнизации процесса (РАИБ, ХММЛ) отмечали некоторое уменьшение относительного количества пролиферирующих клеток с приближением к нормальным показателям у больных с РАИБ. Маркерным в плане оценки степени малигнизации оказался параметр 01(S

2), отражающий динамику изменений кинетического состояния клеток. Указанное соотношение у пациентов с МДС в целом ниже по сравнению с контролем. олученные результаты подтвердили данные [4, 10, 11] о довольно высоком пролиферативном потенциале гемопоэтических клеток больных с МДС.

Таблица 1

Параметры КЦ в контрольной группе

и при различных нозологических формах МДС

*Достоверные отличия в сравнении с контрольной группой, 0,05

роведена оценка относительного содержания клеточных популяций КМ больных с МДС (табл. 2). С помощью корреляционного анализа по Спирману выявили взаимосвязь между относительным содержанием в миелограмме пациентов с МДС бластных клеток, нейтрофильных гранулоцитов (НГ), моноцитов и количеством клеток в разных фазах К диплоидной популяции КМ (табл. 3). Из приведенных данных видно, что морфологически идентифицируемое количество бластных клеток обратно коррелирует с пролиферирующим пулом диплоидной популяции КМ и имеет прямую взаимосвязь с содержанием клеток в фазе покоя 01 К. Данные взаимоотношения являются статистически достоверными. Накопление бластных клеток в фазе 01 свидетельствует о зависимости клеток в фазе покоя от величины опухолевой массы в КМ больных с МДС. ролиферативный потенциал КМ поддерживается, вероятно, за счет более зрелых клеток миелоидной линии гемопоэза вследствие наличия положительной корреляции между количеством клеток в S­ и S 2­фракциях и количеством НГ в миелограмме больных с МДС.

Таблица 2 Миелограммы больных с различными формами МДС

и практически здоровых лиц

*Статистически достоверные отличия по сравнении с нормой, р 0,05, 1палочкоядерные и сегментоядерные НГ

Таблица 3 Корреляционная связь между показателями КЦ диплоидной популяции КМ и показателями миелограмм больных с МДС

*Статистически достоверная корреляция; 1палочкоядерные и сегментоядерные НГ

Учитывая данные взаимоотношения, можнопредположить, что увеличение доли клеток в фазе покоя и соответственно значения цитокинетического параметра 01(S 2) при эволюции в течение заболевания (особенно у пациентов с РАИБ) является отражением накопления опухолевой массы в КМ. Этот факт объясняется тем, что менее зрелые клетки имеют более длительное время прохождения по К согласно данным литературы [4, 12].

ри оценке индивидуальных показателей К и их средних значений отмечена довольно большая вариабельность основных показателей К у пациентов с МДС, что также совпадает с данными других исследователей [6, 13]. В группе практически здоровых лиц отмечали достаточно высокую устойчивость показателей, что свидетельствует о стабильности процессов нормального кроветворения, в отличие от группы пациентов с МДС, где разброс индивидуальных параметров К отражает неэффективную природу гемопоэза. Значения коэффициента вариации (С, %) основных показателей К у больных с МДС и в группе контроля представлены в табл. 4.

Таблица 4

Коэффициент вариации (СV, %) параметров КЦ КМ у лиц контрольной группы и больных с МДС

Наиболее гетерогенная по всем измеряемым параметрам К — группа пациентов с ХММЛ. Это объясняется наличием внутри данной патологии двух вариантов гемопоэза — с миелодиспластическими (МДС­ХММЛ) и миелопролиферативными (МЗ­ХММЛ) признаками, которые отличались значением пролиферативного пула (S 2) — (17,3 ± 3,%) и (26,0 ± 6,6%) соответственно. Более высокая пролиферативная активность гемопоэтических клеток у пациентов с МЗ­ХММЛ имеет значение относительно их лучшей восприимчивости к проводимой терапии. Кроме того, именно в этой группе выявляли наличие анеуплоидных клеточных популяций в КМ у 4 из 12 больных (33%). Все четверо принадлежали к подгруппе МЗ­ХММЛ. Величина их анеуплоидного клеточного пула колебалась от 13 до 70%. ример анализа К КМ пациента с анеуплоидией приведен на рис. 1.

Рис. 1. ДНК­гистограмма клеток КМ больного с МЗ­ХММЛ

Диплоидная популяция клеток выделена черным цветом, анеуплоидная — серым цветом. о горизонтали — количество ДНК в клетках; по вертикали — количество клеток с определенным содержанием ДНК.

Наличие анеуплоидного клона значительно ухудшало прогноз заболевания. Кроме того, существенной является величина анеуплоидной популяции и значение ее плоидности (ДИ). Так, трансформация в ОЛ произошла у 2 из 4 человек с анеуплоидным клоном, один больной умер из­за инфекционных осложнений, еще один имел более благоприятный прогноз вследствие менее выраженной величины анеуплоидной фракции в КМ (12,6%) и ее отсутствия в К. ри этом у этого пациента отмечали наибольшее количество S­фазных клеток в КМ (46%) и в К (40%). Из 4 больных с анеуплоидией у 2 в клетках КМ содержалось околодиплоидное количество ДНК в фазе 01 со значениями ДИ, равными 1,12 и 1,18, у 2 — околотетраплоидное с ДИ 1,84 и 1,86. Таким образом, отмечали равновероятное появление в КМ пациентов с МДС анеуплоидной фракции клеток с различной плоидностью. ри анализе не выявляли зависимости между прогнозом общей выживаемости больных с МДС и значением ДИ.

В табл. представлена взаимосвязь (по Спирману) между основными показателями миелограммы и количеством анеуплоидных клеток в различных фазах К. Согласно полученным данным величина анеуплоидной популяции (% ) и доля клеток в различных фазах К напрямую зависят от количества бластных клеток КМ вследствие того, что клетки опухолевого клона более склонны к анеуплоидии, чем клетки нормальной популяции. ри этом значения величины пролиферирующего клеточного пула (S 2) для обоих вариантов заболевания (диплоидного и анеуплоидного) не имели достоверных различий: (22,1 ± 2,67%) и (21,33 ± 9,00%) соответственно. Независимо от отсутствия или наличия анеуплоидной фракции клеток в КМ больных, вероятно, большим пролиферативным потенциалом обладают более зрелые миелоидные клетки (наличие положительной корреляции между величиной общей S­фракции К и количеством НГ), а величина фазы покоя 01 является отражением величины опухолевого клона.

(рис. 2). Исследования, проведенные С.М. ot­

uo и соавторами [6, 14], также подтвердили предположение о том, что высокий процент клеток в S­ и 2­фазах коррелирует с благоприятным прогнозом заболевания. Это может быть объяснено тем, что величина пролиферативного потенциала у больных МДС отражает степень сохранности пула нормальных гемопоэтических клеток.

Таблица 5

Корреляционная взаимосвязь между показателями КЦ анеуплоидной популяции (Аn) КМ и показателями миелограмм и больных с МДС

*Статистически достоверная корреляция; 1палочкоядерные и сегментоядерные НГ

Для установления взаимосвязи основных показателей К с показателями выживаемости больных, а также характера этой взаимосвязи, проведен регрессионный анализ по Коксу. Результаты анализа позволили выявить следующие цитокинетические параметры, с высокой степенью достоверности отражающие прогноз заболевания, как в пределах группы лиц с отсутствием анеуплоидного клона, так и во всей группе больных с МДС: относительное количество клеток в фазе синтеза для диплоидной популяции — S (p 0,0003), totl S (p 0,002), в пролиферирующем пуле диплоидной популяции — (S

2) (p 0,0002), в фазе покоя для диплоидной по­

пуляции — 01 (p 0,0002), в пре­митотической фазе для диплоидного и анеуплоидного вариантов —

2 (p 0,01) и 2 (p 0,04) соответственно, а также соотношения S01 (p 0,0003) и (S

2)01 (p 0,0002) в пределах диплоидной популяции клеток. Для каждого параметра определяли пограничное значение, по которому классифицировали больных на две группы, достоверно отличающиеся по общей выживаемости. оказано, что больные, в КМ которых 12% и более клеток находятся в S­фазе и свыше 14,6% — в пролиферирующем пуле (S 2), имели более благоприятный прогноз. С другой стороны, наличие в фазе покоя

01 более 8% клеток и значение цитокинетического показателя 01(S 2) больше , соответствовали меньшей продолжительности жизни

Рис. 2. Зависимость кумулятивной доли выживших пациентов с МДС от значения цитокинетического показателя

01

S 2

оказано, что МДС в целом — заболевание с довольно значительным пролиферативным потенциалом; наиболее низкое соотношение 01(S

2) отмечено у пациентов с РА; указанное соотношение повышается по мере накопления бластных клеток в фазе 01. ролиферативная активность поддерживается, вероятно, за счет более зрелых миелоидных клеток, а при наличии анеуплоидной популяции — всех гемопоэтических клеток анеуплоидного клона. Кроме того, при МДС отмечают снижение стабильности (в сравнении с нормой) основных показателей К с довольно значительной вариабельностью пролиферативной активности гемопоэтических клеток КМ. Сопоставление значений основных параметров К с продолжительностью наблюдения больных дало возможность выявить маркерные цитокинетические прогностические критерии, которые в сочетании с клиникогематологическими, цитологическими, цитогенетическими и другими показателями могут уточнить прогноз течения заболевания и общей выживаемости больных с МДС.

ВЫВОДЫ

1. Характеристика К при МДС является важным дополнительным показателем степени злокачественности заболевания, а также имеет прогностическое значение для оценки общей выживаемости больных.
2. МДС является патологией с довольно высоким пролиферативным потенциалом, которым обладают зрелые миелоидные клетки. Увеличение количества< клеток в фазе покоя 01 соответствовало накоплению опухолевой массы (бластные клетки).
3. Отмечена значительная вариабельность основных показателей К у больных с МДС, что отражает неэффективность гемопоэза при данной патологии.
4. Выделены прогностически маркерные цитокинетические параметры. оказано, что при содержании в пролиферативном пуле (S 2) более 14,6%, в фазе покоя 01 менее 8% гемопоэтических клеток, а также при значении цитокинетического параметра, отражающего соотношение (01 (S 2)), менее ,, пациенты с МДС имели более благоприятный прогноз общей выживаемости.

. Выявлено, что наличие анеуплоидной популяции клеток в КМ больных с МДС — один из ведущих факторов неблагоприятного прогноза заболевания.

ЛИТЕРАТуРА

1. Rosenfeld C, List A. hpothss o th pthogss o

   losplst sos: pltos o w thps. u­

   2000; 14 (1): 28.

2. Span LFR, Raymakers RAP, Rytten ESM, De Witte Th. Po­ lto poptoss htsts vto lospls,

   ol bo ow. bst. 7th tg o th EH. H­

   tol J 2002; 2: (supl. 1).

3. Bincoletto C, Saad ST, Soares da Silva E, Queiroz ML. uto­

   oous polto bl­2 xpsso volvg htopo­ t lls ptts wth losplst so. J 1998; 78 (): 6214.

4. Ража А, Мандель С, Шетти В и др. Новые представления о биологии миелодиспластических синдромов: усиленный апоптоз и роль цитокинов. Гематол трансфузиол 1999; 44 (4): 29.

. Винделов Л, Христенсен И. роточный цитометрический анализ ДНК и его применение в клинической и экспериментальной онкологии. Гематол трансфузиол 1994; 39 (6): 812.

1. Riccardi A, Montecucco CM, Danova M, et al. low to­

   t vluto o poltv tvt plo los­ plst sos ut lus. s ppl Hstoh 1986; 30 (2): 18192.

2. Widell S, Hast R, Auer G, et al. N g tot

   S bo ow ss. J Htol 1999; 105: 960.

3. Kakosimos GK, Giotopoulou SG, Dokou ED, et al. ll ­ l lss o bo ow lls wth low tot los­ plst sos. 7th tg o th Eu. H s lo, t­ l, 69 Ju 2002. Htol J 2002; 3 (1): bst.

4. Nicoletti N, Migliorati G, Pagliacci M, et al. p spl tho o sug thot poptoss b popu

   o stg low tot. J u thos 1991; 139: 2719.

5. Шишина РН, Шмаров ДА, Быкова ИА, Козинец ГИ. Сравнительная оценка клеточного цикла миелокариоцитов больных гемодепрессиями. Клин лаборатор диагност 2000; (2): 168.

6. Lin CW, Manshouri T, Jilani I, et al. Polto pop­ toss ut ho lus losplst so.

   u Rs 2002; 26 (6): 19.

7. Span LF, Dar SE, Shetty , et al. ppt xpso o

   34 lls ug th voluto o losplst sos to

   ut lo lu. u 1998; 12 (11): 1689.

8. Шмаров ДА, Кучма ЮМ, Козинец ГИ. роточная цитометрия клеток костного мозга в норме, при анемиях различной этиологии и острых лейкозах. Клин лаборатор диагност 1997; (10): 3.

9. Montecucco C, Riccardi A, Traversi E, et al. low to­

t N ott losplst sos. tot 1983; 4 (3): 23843.