МІКРООТОЧЕННЯ ПУХЛИНИ ТА ІНДЕКС МАСИ ТІЛА ХВОРИХ НА РАК ШЛУНКА: ФОРМУВАННЯ ГРУП ЗА РИЗИКОМ НЕСПРИЯТЛИВОГО ПЕРЕБІГУ

DOI: 10.32471/oncology.2663-7928.t-24-2-2022-g.10456

Ожиріння є однією з основних проблем громадської охорони здоров’я в XXI ст. Починаючи з 1980-х років, поширеність ожиріння у багатьох країнах Європейського регіону підвищилася в 3 рази, і наразі продовжує зростати значними темпами. Поширеність надлишкової маси тіла залишається високою як серед дорослих, так і серед дітей у всьому світі. За даними ВООЗ, у 2016 р. у 39% населення планети віком від 18 років (39% чоловіків і 40% жінок) відмічали надлишкову масу тіла, 13% (11% чоловіків і 15% жінок) — ожиріння. З 1975 до 2016 рр. кількість людей з ожирінням у світі зросла більш ніж утричі. Надмірна маса тіла і ожиріння, які раніше вважалися характерними для країн з високим рівнем доходу, наразі набувають поширення в країнах з низьким і середнім рівнем доходу, особливо в містах. Вагомість проблеми ожиріння визначається загрозою інвалідизації пацієнтів і зменшенням загальної тривалості життя у зв’язку з частим розвитком тяжких супутніх захворювань, зокрема серцево-судинних, цукрового діабету та раку [1–3].

Відомо, що ожиріння підвищує вірогідність виникнення злоякісних пухлин та погіршує перебіг захворювання. Надлишкова маса тіла відповідає за 14% смертності від раку у чоловіків і 20% — у жінок. Але такі закономірності значно залежать від багатьох інших факторів, а саме: типу і характеру ожиріння, статевого та вікового складу контингенту, локалізації пухлин, паління, менопаузи, особливостей лікування, зокрема гормонотерапії та ін. Зокрема, наявність ожиріння у людей похилого віку, порівняно з молодими, підвищує ризик розвитку низки різноманітних захворювань, зокрема і онкологічних [3, 4]. Важливо враховувати і особливості лікування, що застосовується для корекції надлишкової маси тіла. Зокрема відомо, що гіпокалорійна дієта, фізична активність, низка препаратів, хірургічні методи для зменшення маси тіла, асоційовані зі зниженням захворюваності на рак, здатні покращити якість життя та результати лікування онкологічних хворих. Нижнє (гіноїдне) ожиріння пов’язують із соціальними та етнічними факторами і (на відміну від центрального — андроїдного) воно майже не впливає на ризик розвитку раку.

Крім того, жирові депо різної локалізації (наприклад підшкірне та вісцеральне) різняться за особливостями клітинного складу та ендокринною функцією, а відповідно — і за впливом на органи та тканини організму. Зокрема, пухлино-асоційовані адипоцити, що походять з вісцеральної жирової тканини, яка оточує пухлину, є джерелом енергії та адипокінів, що забезпечують її прогресування. Також вирізняють нормальне метаболічне ожиріння, для якого характерні нижчі показники запалення в крові, вищий рівень адипонектину, менш виражені показники ендотеліальної дисфункції та нижчий рівень смертності від раку [5, 6].

Таким чином, вивчення ожиріння в онкологічній клініці потребує як дослідження стану жирової тканини, так і оцінки її негативного впливу на функції органів та тканин. З цієї точки зору найважливішим видається вивчення впливу жирової тканини на пухлину. Визначення асоційованих з ожирінням (з урахуванням віку та статі хворих) факторів пухлинного мікрооточення надасть можливість виявлення пухлин з агресивним фенотипом та формування груп пацієнтів за ризиком несприятливого перебігу захворювання. У перспективі можливе використання таких показників у якості маркерів перебігу пухлинного процесу за наявності у пацієнтів надмірної маси тіла [7]. Такий підхід у майбутньому дозволить покращити персоніфіковане прогнозування перебігу захворювання та ефективності проти­пухлинної терапії, що дозволить подовжити терміни життя хворих на рак.

Рак шлунка (РШ) належить до низки пухлин, що виникають та прогресують у місцях природного накопичення жирової тканини, які за умови ожиріння набувають характеристик хронічного запалення та метаболічного дисбалансу [8, 9]. На сьогодні в якості маркерів прогнозу перебігу РШ досліджено низку факторів пухлинного мікрооточення, серед яких рівень гіпоксії, кількість пухлино-асоційованих макрофагів, щільність мікросудин, активність матриксних металопротеїназ (ММП) [10–14].

Мета цього дослідження — виявити взаємозв’язки між низкою показників мікрооточення РШ та індексом маси тіла (ІМТ) з урахуванням віку і статі пацієнтів; визначити групи осіб, пухлини яких за особ­ливостями мікрооточення характеризуються агресивним фенотипом.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджено зразки пухлинної тканини (після­операційний матеріал) 246 хворих (171 чоловік, 75 жінок) на первинний РШ, які перебували на лікуванні у Київському міському клінічному онкологічному центрі МОЗ України у період 2005–2017 рр. Хворі не отримували передопераційної хіміотерапії, були поінформовані про обстеження і дали згоду на його проведення.

Оцінити ступінь відповідності маси тіла людини її зросту і визначити, чи є маса тіла недостатньою, нормальною або зайвою, дозволяє ІМТ (табл. 1). Цей показник широко використовується в клінічній практиці з метою корекції методів лікування. ІМТ (кг/м²) розраховували за формулою [15]:

де:

• m — маса тіла, кг;• h — зріст, м.

Необхідно зазначити, що у разі використання ІМТ у якості показника ступеня ожиріння потрібно враховувати деякі застереження. Так, при розвиненій мускулатурі високе значення ІМТ визначається не надмірною жировою, а значною м’язевою масою. Для коректного визначення ступеня ожиріння доцільно використовувати такі показники, як співвідношення жирової та м’язевої маси, індекс центрального ожиріння, індекс об’єму тіла тощо. Крім того, класифікація ВООЗ не враховує стать та вік людини. У деяких роботах показано, що для  чоловіків є нормальним ІМТ дещо вищий, ніж для жінок, а для людей середнього віку — дещо вищий, ніж для молодих людей та похилого віку. Причому ці норми різняться для окремих країн [16, 17]. Втім на сьогодні ІМТ є найбільш технічно доступним і найчастіше використовується в клінічній практиці для визначення ступеня ожиріння.

У зразках пухлинної тканини визначали показники, що характеризують мікрооточення РШ: швидкість генерування супероксидних радикалів (СР), активність ММП-2 та -9, експресію білка c-myc, рівень гіпоксії, щільність мікросудин (ЩМС); кількість ГІФ1α (гіпоксія-індукований фактор-1α)- та адипонектинпозитивних клітин, пухлино-асоційованих адипоцитів (ПАА), пухлино-асоційованих макрофагів (ПАМ) і пухлино-інфільтруючих лімфоцитів (ПІЛ). На парафінових зрізах тканини РШ імуногістохімічним методом з використанням специфічних моноклональних антитіл (МкАт) (DakoCytomation, Данія; Sigma, США; Termoscientific, США) визначали кількість клітин, що мали відповідні маркери: CD8⁺ та CD45RO⁺ (ПІЛ); CD34⁺ (ЩМС), CD68⁺ (ПАМ), адипонектин⁺ (АПН); Plin5⁺ (ПАА); ГІФ-1α⁺– та c-myc⁺-клітини. Реакції було візуалізовано за допомогою полімер-пероксидазного методу (EnVision+/HRP, та 3,3-diaminobenzidin; DakoCytomation, Данія) з наступним забарвленням гематоксиліном Майєра. У якості негативного контролю використовували фосфатний буферний розчин як заміну первинних антитіл. CD⁺–клітини підраховували на 1000 клітин на кожному зрізі за збільшення ×400 та виражали у вигляді відсотків. Під час підрахунку кількості CD34⁺ мікросудин (ЩМС) перераховували кількість мікросудин на 1 мм².

Активність ММП-2 та -9 визначали методом зимографії в поліакриламідному гелі (з додаванням желатину в якості субстрата) на основі SDS-електрофорезу білків [18]. Після відмивання гелю активні форми ММП-2 та -9 візуалізувалися у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, локалізація яких визначалася за стандартами молекулярної маси (Sigma, США) і відповідала молекулярній масі кожного із ферментів (72 та 92 kDa відповідно). Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом вимірювання площі зони лізису, використовуючи для порівняння стандартний набір ММП-2 і-9 (Sigma, США). За умовну одиницю (у.о.) прийнято активність 1 мкг фермента в 1 г вихідного конт­ро­ль­­ного зразка. Результати оцінювали за допомогою стандартної програми TotalLab 1.01.

Рівень гіпоксії було оцінено за допомогою ³¹P ядерної магнітної резонансної (ЯМР) спектроскопії перхлорних екстрактів тканин. ³¹P ЯМР-спектри вимірювали на спектрометрі Bruker 400 MHz (Widebore Ultrashield, AV-400 electronics, Німеччина) за 161,976 MHz зі спектральною шириною 64724,9 Hz, 900 шириною імпульсу, лінійним розширенням 10 Hz. За внутрішній стандарт слугувала тринатрієва сіль метилендифосфонієвої кислоти (Sigma, США). Для оцінки рівня гіпоксії в пухлині визначено показник PME/Pi [19].

Рівні генерування СР вимірювали методом електронної парамагнітної резонансної (ЕПР) спектрометрії за технологією Spin Traps (уловлювача радикалів) [20]. Спектри ЕПР реєструвалися за Т = 77 ^оК. Одночасно зі спектрами досліджуваних зразків знімали спектр незалежного стандарту інтенсивності, у якості якого використовували спеціально орієнтований монокристал рубіну з відомою кількістю пара­магнітних центрів. Інтенсивність стандарту прийнято за 1 відносну одиницю вимірювань.

Статистичну обробку даних проводили з використанням методів варіаційної статистики. Дані представлені як М ± m. Вірогідність відмінностей між показниками оцінювали, використовуючи t-критерій Стьюдента. Статистична значущість прийнята за р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведено розподіл хворих на РШ за клініко-патологічними характеристиками та проаналізовано зв’язок між цими характеристиками і показниками ІМТ пацієнтів (табл. 2). Не виявлено залежності між значеннями ІМТ хворих та їх статтю і віком, розміром пухлини (категорія рТ), наявністю реґіонарних метастазів (категорія рN), стадією захворювання (категорія pТNM), ступенем диференціації. Серед пацієнтів з різними за гістологічною структурою пухлинами найвищі значення ІМТ спостерігали у осіб зі слизовим раком, їх середній показник в 1,2 раза достовірно перевищує такий у хворих на недиференційований рак (р <0,05). У пацієнтів без віддалених метастазів ІМТ достовірно вищий за цей показник у хворих з наявними віддаленими метастазами (р <0,05). Показники ІМТ у осіб з анатомічною локалізацією пухлини у верхній третині шлунка перевищують (р <0,05) такі у пацієнтів з тотальним ураженням шлунка.

*p<0,05 у порівнянні з показниками відповідної категорії.
З урахуванням віку, статі та маси тіла всіх пацієнтів було розподілено на 8 груп за наступними критеріями: ІМТ <25 кг/м² (нормальна маса тіла) — 111 пацієнтів, ≥25 кг/м² (надмірна маса тіла — перед­ожиріння або ожиріння) — 135 пацієнтів (за класифікацією ВООЗ) [15]; вік ≤60 років (переважно середнього віку) — 110 пацієнтів, >60 року (переважно похилого віку) — 136 пацієнтів; за статтю — 171 чоловік та 75 жінок (табл. 3). Загалом визначено 8 груп пацієнтів (див. табл. 4): 1-ша — чоловіки середнього віку з нормальною масою тіла; 2-га — чоловіки похилого віку з нормальною масою тіла; 3-тя — жінки середнього віку з нормальною масою тіла; 4-та — жінки похилого віку з нормальною масою тіла; 5-та — чоловіки середнього віку з надмірною масою тіла; 6-та — чоловіки похилого віку з надмірною масою тіла; 7-ма — жінки середнього віку з надмірною масою тіла; 8-ма — жінки похилого віку з надмірною масою тіла.

Примітка: напівжирний курсив — пропухлинні характеристики; курсив — протипухлинні характеристики; звичайний шрифт — різниця недостовірна.
Таким чином, у когорті обстежених хворих кількість пацієнтів з надмірною масою тіла та осіб похилого віку на 30,0 та 35,0% відповідно переважає кількість пацієнтів з нормальною масою тіла та хворих середнього віку, а кількість чоловіків була у 2,5 раза більша за кількість жінок. Склад когорти за ІМТ, віком та статтю відповідає відомостям щодо захворюваності на РШ [10, 12–14].

Нами було визначено медіану за кожним дослідженим показником мікрооточення як для загальної групи хворих, так і окремо для кожної з виділених 8 груп. Отримана матриця значень лягла в основу подальшого аналізу стану пухлинного мікрооточення за ІМТ, віком та статтю пацієнтів.

На рисунку наведено медіани значень кожного з досліджених показників хворих на РШ різних груп. Найвищі показники кількості ПАА спостерігали в групі чоловіків похилого віку з передожирінням/ожирінням, а найменшу кількість АПН⁺-клітин — у пухлинах жінок похилого віку з передожирінням/ожирінням (див. рисунок (І, IІ)). У пухлинах чоловіків похилого віку з нормальною масою тіла виявлено високі показники швидкості генерування СР та низькі співвідношення PME/Pi, тобто глибоку гіпоксію (див. рисунок (ІІІ, ІV)). Пухлини чоловіків похилого віку з передожирінням/ожирінням характеризуються високими значеннями ГІФ-1α⁺-, CD68⁺-клітин та ЩМС, досить великою кількістю CD8⁺-клітин та низькими значеннями c-myc⁺-клітин і активності желатиназ (див. рисунок (V–XII)). Таким чином, виокремлені за ІМТ, віком та статтю групи хворих суттєво відрізнялися за балансом про- та протипухлинних факторів мікрооточення РШ.

Рисунок. Медіани показників ПАА (I), АПН (II), O2^● (III), PME/Pi (IV), ГІФ-1α (V), ЩМС (VI), CD68 (VII), CD8 (VIII), CD45RO (IX), c-myc (X), ММП-2 (XI), ММП-9 (XII) хворих на РШ різних груп (горизонтальна лінія — медіана для загальної групи пацієнтів)

Вищенаведені факти стали підґрунтям для створення матриці про- та протипухлинних факторів мікрооточення РШ, які характерні для кожної групи хворих, виокремлених за ІМТ, віком та статтю. Спираючись на відомості щодо впливу досліджених факторів на пухлинну прогресію, для показників ПАА, O₂^●, ГІФ-1α, ЩМС, CD68, c-myc, ММП-2, ММП-9 пропухлинними вважали рівні, вищі за медіану для загальної групи пацієнтів; відповідно, проти­пухлинними вважали рівні, нижчі за медіану для загальної групи пацієнтів. Для інших показників — навпаки. У табл. 4 наведено розраховані у відсотках значення співвідношень медіан досліджених показників мікрооточення в кожній виділеній групі (М*) до медіани відповідного показника в загальній когорті хворих (М**).

З табл. 4 видно, що в пухлинах хворих груп 5–8 з передожирінням/ожирінням (ІМТ >25 кг/м²) загалом кількісно переважають достовірно вищі пропухлинні значення показників мікрооточення, порівняно з пухлинами пацієнтів з нормальною масою тіла (ІМТ ≤25кг/м²). Але серед них вирізняється група жінок середнього віку з надмірною масою тіла, в пухлинах яких лише 2 показники мікрооточення мають пропухлинне значення. Водночас, серед пацієнтів з нормальною масою тіла виділяються групи чоловіків середнього віку та жінок похилого віку, у пухлинах яких половина визначених показників мають пропухлинне значення.

У чоловіків похилого віку незалежно від наявності ожиріння мікрооточення РШ має більш агресивний характер порівняно з жінками цієї ж вікової групи (>60 років) та чоловіками середнього віку. Протипухлинні значення показників мікрооточення пухлини переважають у чоловіків похилого віку (>60 років) з нормальною масою тіла (ІМТ ≤25кг/м²). Найбільш агресивним (р <0,05) пропухлинним мікрооточенням вирізняється РШ у чоловіків середнього та жінок похилого (>60 років) віку з перед­ожирінням/ожирінням.

Таким чином, можна припустити, що наявність надмірної маси тіла як така не означає несприятливого впливу ожиріння, а значить, у разі онкологічного захворювання не призводить до пропухлинного впливу жирової тканини. Тож, ми плануємо в подальшому проаналізувати у визначених групах хворих показники дисемінації пухлинних клітин, метастазування та виживаності. У підсумку, виявлення факторів пухлинного мікрооточення, асоційованих з ожирінням, дозволить формувати групи пацієнтів за ризиком несприятливого перебігу захворювання, покращити персоніфіковане прогнозування та ефективність протипухлинної терапії.

ВИСНОВКИ

1. Наявність надмірної маси тіла у пацієнтів з онкологічним захворюванням не призводить однозначно до пропухлинного впливу жирової тканини.

2. Виявлення асоційованих з ожирінням факторів пухлинного мікрооточення дозволить формувати групи пацієнтів за ризиком несприятливого перебігу захворювання, покращити персоніфіковане прогнозування та ефективність протипухлинної терапії.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Mastrocola MR, Roque SS, Benning LV, Stanford FC. Obesity education in medical schools, residencies, and fellowships throughout the world: a systematic review. Int J Obes 2020; 44 (2): 269–79. doi: https://doi.org/10.1038/s41366-019-0453-6.
2. Інформаційний бюлетень ВООЗ, 2021 р. https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight
3. Saitta C, Pollicino T, Raimondo G. Obesity and liver cancer. Ann Hepatol 2019, 18 (6): 810–5. doi: https://doi.org/10.1016/j.aohep.2019.07.004.
4. Goossens GH, Blaak EE. Adipose tissue dysfunction and impaired metabolic health in human obesity: a matter of oxygen. Front endocrinol (lausanne) 2015; 6 (55): 1–5. doi: https://doi.org/10.3389%2Ffendo.2015.00055.
5. Colditz G, Peterson L. Obesity and cancer: evidence, impact, and future directions. clinical chemistry 2018; 64 (1): 154–62. doi: https://doi.org/10.1373/clinchem.2017.277376.
6. Alexandre L, Long E, Beales L. Pathophysiological mechanisms linking obesity and esophageal adenocarcinoma. World J Gastrointest Pathophysiol 2014; 5 (4): 534–49. doi: https://doi.org/10.4291%2Fwjgp.v5.i4.534.
7. Reaves DK, Ginsburg E, Bang JJ, et al. Persistent organic pollutants & obesity: potential mechanisms for breast cancer promotion? Endocr relat cancer 2015; 22 (2): 69–86. doi: https://doi.org/10.1530/erc-14-0411.
8. Wu H, Ballantyne CM. Metabolic inflammation and insulin resistance in obesity. Circulation Research 2020; 126: 1549–64. doi: https://doi.org/10.1161/circresaha.119.315896.
9. Nurul M, Hussain AS, Sarwar S, et al. How the association between obesity and inflammation may lead to insulin resistance and cancer. Diabetes Metab Syndr 2019; 13 (2):1213-24. doi: 10.1016/j.dsx.2019.01.041.
10. Bubnovskaya L, Osinsky D. Tumor microenvironment and metabolic factors: contribution to gastric cancer. Exp Oncol 2020; 42 (1): 2–10. doi: 10.32471/exp-oncology.2312-8852.vol-42-no-1.14056.
11. Chen Y, Zhang S, Wang Q, Zhang X. Tumor-recruited M2 macrophages promote gastric and breast cancer metastasis via M2 macrophage-secreted CHI3L1 protein. J Hematol Oncol 2017;10: 36. doi: https://doi.org/10.1186/s13045-017-0408-0.
12. Carlomagno N, Incollingo P, Tammaro V, et al. Diagnostic, predictive, prognostic, and therapeutic molecular biomarkers in third millennium: a breakthrough in gastric cancer. Biomed Res Int 2017: ID7869802. doi: https://doi.org/10.1155/2017/7869802.
13. Chang WJ, Du Y, Zhao X. Inflammation-related factors predicting prognosis of gastric cancer. World J Gastroenterol 2014; 20: 4586–96. doi: https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i16.4586.
14. Bibak F, Ahmadi S, Khateri Z, Ahmadi A, et al. The role of matrix metalloproteinase-2 expression in gastric cancer susceptibility: a systematic review. Int J Cancer Manag 2019; 12 (9): e94185. doi: https://dx.doi.org/10.5812/ijcm.94185.
15. WHO Mean Body Mass Index (BMI). World Health Organization 2019, Retrieved 5. https://www.who.int/europe/news-room/fact-sheets/item/a-healthy-lifestyle—who-recommendations.
16. Blackburn H, Jacobs D. Commentary: Origins and evolution of body mass index (BMI): continuing saga. Int J Epidemiol 2014; 43 (3): 665–9. doi: https://doi.org/10.1093/ije/dyu061.
17. Nuttall FQ. Body mass index obesity, BMI, and health. Nutrition Research 2015; 50 (3): 117–28. doi: https://doi.org/10.1097/nt.0000000000000092.
18. De Clerk YA, Perez N, Shimada H, et al. Inhibition of invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases. Cancer res 1992; 52: 701–8.
19. Vaupel P, Okunieff P, Kallinowski F. et al. Correlation between 31P-NMR spectroscopy and tissue O2 tention measurements in a murine fibrocarcoma. Radiation Res 1989; 120: 477–93.
20. Burlaka AP, Sidorik EP, Ganusevich II, et al. High formation of superoxide anion and nitric oxide, and matrix metalloproteinases activity in vascular wall of rectal carcinoma vessels. Exp Oncol 2006; 28: 323–5.

Адреса для листування:

Ганусевич І.І.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології iм. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: iganus2013@gmail.com

Одержано: 13.06.2022